本研究于2021年5月25日发表在期刊 International Journal of Molecular Sciences 上，文章标题为“Adenosine and Cordycepin Accelerate Tissue Remodeling Process Through Adenosine Receptor Mediated Wnt/β-Catenin Pathway Stimulation by Regulating GSK3b Activity”。主要作者为Jaeyoon Kim，其所属机构包括韩国LG生活健康（LG H&H）研发中心以及忠南大学医学院皮肤科。合作作者包括Jae Young Shin, Yun-Ho Choi, So Young Lee, Mu Hyun Jin, Chang Deok Kim, Nae-Gyu Kang及通讯作者Sanghwa Lee（同样来自LG H&H研发中心）。
研究的学术背景 本研究属于皮肤生物学、分子药理学与组织再生领域的交叉研究。皮肤作为人体最大的器官，其伤口的有效愈合对于维持机体稳态和防止感染至关重要。伤口愈合是一个复杂的动态过程，涉及炎症、增殖和重塑三个阶段，需要多种细胞（如成纤维细胞、角质形成细胞）和细胞因子/生长因子的协同作用。然而，异常愈合会导致疤痕形成或慢性溃疡，因此寻找能够促进高效、高质量（如减少疤痕）组织修复的药物靶点和化合物是当前研究热点。 腺苷（Adenosine）是一种普遍存在的嘌呤核苷，在细胞能量代谢和信号传导中扮演重要角色。研究表明，在组织损伤或代谢压力下，细胞外腺苷水平会升高，并通过激活其G蛋白偶联受体（Adenosine Receptors， 主要为A2A和A2B亚型）来促进组织保护和修复，例如增加血供、对抗炎症和促进血管生成。虫草素（Cordycepin， 3’-脱氧腺苷）是来源于药用真菌蛹虫草（Cordyceps militaris）的天然腺苷衍生物，具有抗炎、抗氧化等多种药理活性，但其在皮肤伤口愈合，特别是通过腺苷受体介导的信号通路中的作用机制尚不明确。 同时，Wnt/β-catenin信号通路是胚胎发育和组织再生的关键调控通路，其在成人皮肤伤口愈合中的作用日益受到重视。该通路的激活可以促进细胞增殖、迁移和生长因子的分泌。然而，腺苷及其衍生物是否以及如何通过调控Wnt/β-catenin通路来促进组织重塑，其中的分子连接机制尚未被阐明。 基于以上背景，本研究旨在探究腺苷和虫草素是否能够促进皮肤伤口愈合过程，并重点阐明其分子机制，特别是它们是否通过激活腺苷受体来刺激Wnt/β-catenin通路，从而加速组织重塑。研究的核心目标是确定腺苷和虫草素在人类皮肤成纤维细胞中的药理作用靶点和下游信号网络，评估其促进组织修复的潜力。
详细研究流程 本研究采用体外细胞模型，系统性地探究了腺苷和虫草素对人真皮成纤维细胞的作用。整体工作流程包含多个相互关联的实验模块，逻辑严谨，从受体表达分析开始，逐步深入到信号通路激活、基因表达变化、功能验证和机制解析。
第一部分：腺苷受体亚型表达谱分析与腺苷/虫草素对细胞代谢和增殖的影响。 研究首先确定了处理细胞的对象：体外培养的人真皮成纤维细胞。研究初期，通过定量RT-PCR技术分析了四种腺苷受体亚型（A1， A2A， A2B， A3）在成纤维细胞中的mRNA表达水平。结果显示，A2B受体（ADORA2B）的表达量最高，约为A1和A2A受体的13倍，而A3受体几乎检测不到。这一发现提示，在成纤维细胞中，腺苷及其衍生物的生理效应很可能主要通过A2B受体介导。 为了验证腺苷和虫草素能否激活成纤维细胞中的腺苷受体通路，研究进行了以下关键实验： 1. 细胞内cAMP水平测定：由于A2B受体与Gs蛋白偶联，其激活会导致细胞内第二信使cAMP水平升高。研究人员用腺苷、虫草素以及人工合成的腺苷受体激动剂NECA处理成纤维细胞4小时，随后使用商品化的cAMP检测试剂盒测量cAMP浓度。结果证实，三者均能在短时间内显著提高细胞内cAMP水平，表明腺苷受体信号被成功激活。 2. 线粒体膜电位（Δψ）检测：cAMP信号的激活与能量代谢增强相关。研究使用JC-1荧光染料检测线粒体膜电位的变化，这是反映线粒体功能状态和能量代谢活性的指标。处理4小时后，腺苷和虫草素均能显著增强成纤维细胞的线粒体膜电位。此外，蛹虫草水提物（Cordyceps militaris extract， CME）也呈现剂量依赖性的增强效果，且后续分析证实CME中含有腺苷和虫草素。 3. 相关基因表达分析：研究人员通过定量RT-PCR检测了与cAMP通路和细胞周期相关的基因表达。处理一天和两天后，腺苷和虫草素均能上调cAMP反应元件结合蛋白1（CREB1）、原癌基因MYC、糖原合酶激酶3β（GSK3B）以及细胞增殖标志物Ki67和细胞周期蛋白D1（CCND1）的mRNA水平，且两天处理的效果更为显著。这从基因层面支持了腺苷受体通路被激活并促进了细胞代谢与增殖进程。
第二部分：腺苷和虫草素对Wnt/β-catenin信号通路的激活作用验证。 在初步确认腺苷受体激活后，研究转向探索其与组织再生关键通路——Wnt/β-catenin通路的关系。 1. Wnt报告基因检测：为了直接评估对经典Wnt通路活性的影响，研究使用了稳定转染了Wnt反应元件（TCF/LEF）驱动荧光素酶报告基因的细胞系（WRHEK293A）。将细胞分别用不同浓度的腺苷、虫草素、NECA和CME处理24小时后，检测荧光素酶活性。结果显示，所有处理均能剂量依赖性地增强荧光素酶活性，其中腺苷和虫草素的作用明确，证明它们可以作为Wnt/β-catenin信号的激动剂。 2. 成纤维细胞中Wnt通路相关基因表达谱分析：为了更全面地了解腺苷和虫草素对成纤维细胞转录组的影响，研究进行了大规模的基因表达谱筛选（检测132个基因）。通过聚类分析和KEGG通路富集分析发现，腺苷和虫草素处理后显著上调的基因主要富集在“多细胞生物过程”、“细胞发育”以及“Hippo信号通路”和“Wnt信号通路”等通路上。这从生物信息学角度预测了二者对Wnt通路的激活作用。 3. 特定Wnt靶基因验证：基于上述筛选结果，研究人员通过定量RT-PCR进一步验证了多个Wnt通路相关基因的表达变化。在成纤维细胞中，腺苷和虫草素处理（1天和2天）能显著上调Wnt经典靶基因，如骨形态发生蛋白2/4（BMP2/4）、淋巴增强子结合因子1（LEF1）以及β-连环蛋白（CTNNB1）的mRNA水平。Wnt受体Frizzled 3/5（FZD3/5）的表达也有所增加。这些数据在成纤维细胞自身体系中直接证实了Wnt/β-catenin通路的转录激活。
第三部分：连接腺苷受体与Wnt通路的分子机制探究。 这是本研究的核心机制探索部分，旨在揭示腺苷受体信号如何传导至Wnt通路。 1. 关键信号蛋白磷酸化状态分析：为了寻找信号传递的中间节点，研究人员首先使用抗体芯片（Dot Blot）检测了17种MAP激酶（MAPK）的磷酸化水平。发现经过腺苷和虫草素处理一天后，MEK1/2、mTOR和p70S6K的磷酸化显著增强。特别重要的是，GSK3β在Ser9位点的磷酸化（p-GSK3β-S9）也显著增加。GSK3β是Wnt通路的关键负调控因子，其Ser9位点的磷酸化会抑制其激酶活性，从而稳定β-catenin，激活下游转录。 2. GSK3β磷酸化的独立验证：为了确证上述发现，研究进行了标准的蛋白质免疫印迹（Western Blot）分析。在腺苷和虫草素处理成纤维细胞4小时后，p-GSK3β-S9的蛋白水平显著升高，而总GSK3β蛋白量不变，计算得出的p-GSK3β/GSK3β比值显著增加。这强有力地证实了腺苷和虫草素能够通过增加抑制性磷酸化来调控GSK3β的活性。 3. 抑制剂实验验证信号传导路径：为了建立因果链，研究使用了药理学抑制剂进行干预实验。在成纤维细胞中，腺苷和虫草素诱导的Wnt靶基因（如BMP4和CREB1）表达上调，可被腺苷A2A受体特异性抑制剂ZM241385和A2B受体特异性抑制剂PSB603所阻断。然而，这两种抑制剂对重组Wnt3a蛋白直接激活的基因表达没有影响。这表明腺苷和虫草素的作用位于Wnt信号的上游，且依赖于腺苷受体（主要是A2A和A2B）的激活。 更重要的是，研究使用了蛋白激酶A（PKA）抑制剂H89。PKA是cAMP下游的关键效应激酶，已知可以磷酸化GSK3β的Ser9位点。实验发现，H89不仅能抑制腺苷和虫草素诱导的基因表达，也能部分抑制由Wnt3a直接激活的基因表达。这一结果将腺苷受体-cAMP-PKA轴与GSK3β磷酸化和Wnt通路激活直接联系起来。
第四部分：腺苷和虫草素促进组织修复相关功能的验证。 在阐明分子机制后，研究进一步在细胞功能层面验证了腺苷和虫草素促进伤口愈合的潜力。 1. 生长因子分泌分析：伤口愈合依赖于多种生长因子的协同作用。研究通过定量RT-PCR和抗体芯片（Dot Blot）检测了处理前后成纤维细胞中多种生长因子的表达和分泌情况。结果显示，腺苷和虫草素能上调表皮生长因子（EGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、转化生长因子β1/2/3（TGFβ1/2/3）、血小板衍生生长因子（PDGF）和血管内皮生长因子（VEGFA）的mRNA水平，并在细胞裂解液和培养上清液中检测到相应蛋白分泌的增加，其中TGFβ3的分泌增加最为显著。 2. 细胞迁移能力评估（划痕实验）：成纤维细胞向伤口床的迁移是愈合增殖期的关键步骤。研究使用了标准的细胞划痕愈合实验（scratch assay）。将成纤维细胞培养在特制的培养插件中，移除插件形成无细胞划痕区后，加入腺苷、虫草素或Wnt3a处理，并在第1天和第2天拍照记录。通过图像分析软件（Image J）量化细胞迁移面积。结果表明，腺苷和虫草素能显著加快成纤维细胞的迁移速率。 3. 细胞骨架重组观察：细胞迁移依赖于细胞骨架（尤其是肌动蛋白丝）的动态重组。通过免疫荧光染色，研究人员观察了β-微管蛋白和F-肌动蛋白（用鬼笔环肽标记）的分布。发现经腺苷、虫草素或NECA处理后，成纤维细胞内的F-肌动蛋白荧光信号显著增强，表明肌动蛋白丝的形成和细胞骨架重组被促进，这为观察到的迁移能力增强提供了细胞形态学依据。
主要研究结果 本研究获得了一系列层层递进、相互印证的结果： 1. 受体表达基础：人真皮成纤维细胞中，腺苷受体A2B亚型表达占主导地位。 2. 腺苷受体通路激活：腺苷和虫草素能迅速升高成纤维细胞内cAMP水平，增强线粒体膜电位，并上调CREB1、MYC、Ki67等与代谢和增殖相关基因的表达，证实了腺苷受体信号的成功激活。 3. Wnt/β-catenin通路被激活： * 报告基因系统：在WRHEK293A细胞中，腺苷和虫草素剂量依赖性地激活Wnt报告基因。 * 基因表达谱：在成纤维细胞中，二者处理引起的差异表达基因显著富集于Wnt信号通路。 * 靶基因验证：BMP2/4， LEF1， CTNNB1等经典Wnt靶基因的mRNA水平被显著上调。 4. 核心分子机制： * 腺苷和虫草素处理增加了MEK1/2， mTOR， p70S6K等多条通路的磷酸化。 * 最关键的是，它们显著增加了GSK3β在Ser9位点的抑制性磷酸化（p-GSK3β-S9）。 * 腺苷受体抑制剂（ZM241385， PSB603）能特异性阻断腺苷/虫草素诱导的Wnt靶基因表达，但不影响Wnt3a的直接激活，证明腺苷受体的作用位于上游。 * PKA抑制剂（H89）能阻断腺苷/虫草素以及部分阻断Wnt3a诱导的基因表达，将cAMP-PKA信号与GSK3β磷酸化和Wnt通路激活直接串联起来。 5. 促进组织修复的功能性结果： * 腺苷和虫草素能促进成纤维细胞分泌多种对伤口愈合至关重要的生长因子，特别是IGF-1和TGFβ3。 * 二者能显著加速成纤维细胞在划痕实验中的迁移速度。 * 它们能促进成纤维细胞中F-肌动蛋白的聚合，表明细胞骨架重组和运动能力增强。
这些结果逻辑关系紧密：从确认靶细胞（成纤维细胞）的受体表达谱开始，到证实化合物激活受体及其下游cAMP代谢，进而发现其对Wnt通路的意外激活作用；通过磷酸化组学找到关键节点GSK3β，并用抑制剂实验构建了“腺苷/虫草素 → 腺苷受体（A2A/A2B）→ cAMP ↑ → PKA激活 → GSK3β Ser9磷酸化（失活）→ β-catenin稳定 → Wnt靶基因转录激活”的完整信号传导链条；最后，在基因表达、蛋白质分泌、细胞迁移和形态等多个功能层面验证了该信号链条活化所带来的促进组织修复的生物学效应。
研究结论与意义 本研究得出结论：腺苷及其天然衍生物虫草素，能够通过激活人真皮成纤维细胞上的腺苷受体（主要是A2A和A2B亚型），进而刺激Wnt/β-catenin信号通路。其核心机制在于，腺苷受体激活后升高的cAMP激活了PKA，PKA随后磷酸化并抑制了GSK3β的活性。GSK3β作为Wnt通路的关键负调控因子，其失活导致β-catenin稳定和核转位，最终驱动一系列促进组织修复的基因表达程序。这一过程具体表现为线粒体能量代谢增强、多种生长因子（如IGF-1， TGFβ3）分泌增加、以及成纤维细胞迁移能力提升，从而在细胞和分子水平上模拟并加速了伤口愈合的组织重塑阶段。 本研究的科学价值在于首次详细阐明了腺苷和虫草素在皮肤成纤维细胞中连接腺苷受体信号与Wnt/β-catenin通路的具体分子桥梁——即通过cAMP/PKA依赖的GSK3β Ser9磷酸化。这为理解嘌呤能信号在组织再生中的复杂调控网络增添了新的重要环节。其应用价值显著：研究结果强有力地支持了腺苷和虫草素作为促进皮肤伤口愈合的潜在治疗剂或“妆药”（cosmeceutical）成分。特别是虫草素作为天然产物，可能提供一种相对安全有效的促进修复、减少疤痕（通过调节TGFβ3/TGFβ1比例）的新选择。研究也为开发靶向腺苷受体或下游PKA/GSK3β轴的新型促愈合药物提供了理论依据和候选化合物。
研究亮点 1. 机制创新性：本研究首次系统揭示了腺苷和虫草素通过“腺苷受体-cAMP-PKA-GSK3β”轴激活Wnt/β-catenin通路的完整信号传导路径，明确了GSK3β作为两个重要通路交汇点的核心作用。 2. 研究系统性：从受体分析、第二信使检测、转录组筛选、信号蛋白磷酸化图谱、到关键节点的遗传/药理学验证（抑制剂实验），再到最终的细胞功能学表型（迁移、生长因子分泌），研究设计逻辑严密，证据链完整。 3. 靶点与化合物的双重价值：不仅深入探究了已知促愈合靶点腺苷受体的新下游机制，还评估了天然产物虫草素在该通路上的激动剂活性，为其临床应用提供了坚实的临床前数据。 4. 功能表型与机制紧密关联：研究没有停留在信号通路描述，而是将分子机制的发现与促进生长因子分泌、增强细胞迁移等直接关乎伤口愈合质量的关键功能表型有机结合起来，提升了研究的生理相关性和转化潜力。
其他有价值的要点 研究在讨论部分还提出了若干有前瞻性的观点：例如，考虑到皮肤伤口多为体表局部问题，局部外用腺苷或虫草素制剂可能有效规避其潜在的全身性副作用（如对心脏的影响），因为腺苷的血浆半衰期极短，且局部给药系统可以控制其渗透。此外，作者将促进真皮组织重塑的思路拓展到了皮肤抗衰老领域（“化妆品领域”），认为真皮细胞外基质的合成与重塑在伤口修复和对抗皮肤老化中存在共性，因此腺苷和虫草素也可能作为改善皮肤老化的活性成分，这拓宽了研究成果的应用场景。