学术研究报告：跨物种反应性TfR1结合VHH的鉴定与优化作为跨越血脑屏障的药物递送工具

第一作者及机构
本研究由Marion David（1,2,#,*）和Romy Cohen（2,#）共同主导，合作单位包括法国艾克斯-马赛大学（Aix Marseille Univ）、CNRS、Vect-Horus SAS等机构。研究预印本发布于bioRxiv（2025年5月23日），DOI: 10.¹¹⁰¹⁄₂₀₂₅.05.23.649291。

学术背景
血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）是中枢神经系统（CNS）药物递送的主要障碍，尤其阻碍大分子生物治疗药物（如抗体、肽类）的入脑效率。转铁蛋白受体1（Transferrin Receptor 1, TfR1）是BBB内皮细胞高表达的受体，通过受体介导的转胞吞作用（Receptor-Mediated Transcytosis, RMT）可促进药物跨BBB递送。然而，现有TfR1靶向分子多缺乏跨物种反应性（如小鼠、猕猴与人类TfR1的交叉结合能力），阻碍了临床前到临床的转化。本研究旨在开发一种基于骆驼源单域抗体（Variable domain of Heavy chain-only antibody from camelids, VHH）的分子穿梭工具，通过优化其结合特性实现跨物种BBB递送。

研究流程
1. TfR1稳定细胞系的构建
- 克隆小鼠、人类和猕猴TfR1全长基因，与EGFP融合后转染CHO细胞，建立稳定表达TfR1-EGFP的细胞系（CHO-mTfR1-EGFP等）。通过免疫荧光和Western blot验证受体表达及定位。
- 样本量：每个物种筛选至少3个独立克隆。

1. VHH文库的构建与筛选

   • 免疫一只雄性羊驼（Llama），采用交替免疫策略（先后使用人类和小鼠TfR1膜提取物）。通过噬菌体展示技术，从外周血单核细胞中构建VHH文库（约10^8克隆）。
     
   • 采用交叉筛选策略：在CHO-mTfR1-EGFP和CHO-hTfR1-EGFP细胞上进行4轮交替选择，结合去除非特异性结合的“掩蔽”步骤。
     
   • 筛选结果：从744个克隆中鉴定出284个同时结合小鼠和人类TfR1的VHH，最终聚焦于C5、B8、H3（交叉反应性）和B6（人类特异性）四个VHH。

2. VHH结合特性表征

   • 流式细胞术：测定VHH与TfR1的亲和力（Kd/app），显示C5、B8对小鼠TfR1的Kd为7.1-60 nM，对人类/猕猴TfR1为1.5-4.2 nM。
     
   • 表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）：分析结合动力学参数（Kon/Koff），发现B8亲和力高于C5（3-6倍），且主要差异源于解离速率（Koff）。
     
   • 竞争实验：证实VHH不与内源性配体（转铁蛋白TF）竞争结合TfR1，靶向表位位于TfR1二聚体界面（非TF结合区域）。

3. 表位定位与突变分析

   • 人类TfR1突变体库：通过单点突变和双突变策略，鉴定出C5/B8的关键结合残基（如E634、G636、E728等），定位其表位为TfR1螺旋-顶端结构域交界区。
     
   • 跨物种序列比对：该表位在人类、小鼠和猕猴TfR1中的相似性分别为95.8%和83.3%，解释了VHH的交叉反应性差异。

4. VHH-Fc融合蛋白的构建与功能验证

   • 将VHH（C5、B8）与人类IgG1 Fc段（hFc）融合，构建二价（(VHH)₂-hFc*）和单价（(VHH)₁-hFc）形式。
     
   • 体外实验：
     
     • 细胞摄取：CHO-TfR1-EGFP和原代脑微血管内皮细胞（mBMEC、hBMEC）中，VHH-Fc显示TfR1依赖性内化。
       
     • 亲和力提升：二价形式的Kd/app较单价提高14倍（小鼠TfR1），但单价形式更利于跨BBB递送。
       

5. 体内药效学评估

   • 脑递送效率：C57BL/6小鼠静脉注射VHH-Fc后，单价C5/B8-hFc的脑-血浆比显著高于二价形式（13倍 vs 对照）。
     
   • 神经降压素（Neurotensin, NT）诱导的低体温模型：
     
     • VHH-NT(8-13)融合后，单价C5/B8在野生型小鼠中诱导显著低体温（ΔT=-7°C），证实BBB穿透和NT受体（NTSR1）激活。
       
     • B-hTFR转基因小鼠（表达人类TfR1）中，优化后的VHH变体（如B8v31h3，Kd=210.8 nM）显示高效递送，其低体温效应与Koff速率正相关（Pearson r=-0.78, p=0.003）。

主要结果与逻辑关联
- 跨物种结合特性：C5/B8 VHH通过靶向保守表位实现小鼠-人类-猕猴TfR1交叉反应，其亲和力差异由Koff主导（SPR数据）。
- 表位新颖性：不同于既往TfR1靶向分子（如靶向顶端结构域的抗体），C5/B8结合二聚体界面，避免与内源性配体竞争。
- 递送优化：单价VHH-Fc在体内表现出更优的脑累积，而高亲和力变体（如B8v34）因滞留BBB内皮导致递送效率下降。

结论与价值
1. 科学价值：首次报道靶向TfR1二聚体界面的VHH，揭示了结合动力学（尤其是Koff）对BBB转胞吞效率的关键影响。
2. 应用价值：C5/B8及其变体可作为通用型分子穿梭平台，递送抗体、核酸等治疗载荷至CNS，支持从啮齿类到非人灵长类的临床前转化。

研究亮点
- 创新技术：交替免疫策略结合噬菌体交叉筛选，高效获得跨物种VHH。
- 表位发现：鉴定出TfR1新型功能表位，为理性设计递送工具提供结构基础。
- 体内-体外相关性：建立SPR参数（Kd/Koff）与体内药效（低体温模型）的定量关系，指导后续优化。

其他价值
- 提出的“中等亲和力+快速解离”优化原则，为其他RMT受体靶向策略提供参考。
- 人类化变体（如B8v31h3）兼具临床转化潜力和猴子模型验证能力，加速神经退行性疾病药物的开发。