本研究由来自法国、美国、丹麦、瑞士、德国等多个研究机构的团队合作完成。其中，主要作者包括Annabelle Gérard、Adam Woolfe、Guillaume Mottet、Marcel Reichen、Carlos Castrillon、Vera Menrath、Sami Ellouze、Adeline Poitou、Raphael Doineau等（共16位并列第一作者），以及Annabelle Gérard、Allan Jensen、Andrew D. Griffiths、Pierre Bruhns、Colin Brenan等（共5位共同通讯作者）。主要机构有Hifibio Therapeutics SAS、Institut Pasteur、ESPCI Paris、AbbVie Bioresearch Center等。该研究发表于期刊《Nature Biotechnology》。
这项研究的科学领域属于免疫学、生物技术及微流控技术的交叉领域，具体聚焦于抗体发现与免疫组库分析。研究的核心动机源于从生物体（如人或小鼠）的免疫系统中高效、准确地发现和表征有用抗体（尤其是针对膜蛋白等困难靶点）的巨大需求。传统的抗体发现方法，如杂交瘤技术、噬菌体展示等，存在通量低、无法保留天然的重链-轻链（VH-VL）配对、难以筛选膜抗原结合抗体、或无法将抗体的表型（如结合活性）与其基因型（序列）高通量地耦合分析等局限性。因此，开发一种能够高通量筛选分泌IgG的原始细胞（如浆细胞、浆母细胞），同时保留其天然VH-VL配对信息，并可适用于可溶抗原与膜结合抗原的平台，具有重要的研究与应用价值。本研究旨在开发这样一个名为“Celligo”的集成平台，以实现从免疫后小鼠或体外激活的人类记忆B细胞中，高通量地发现、筛选和测序功能性抗体。
研究的详细工作流程可以概括为四个主要阶段：基于微流控液滴的高通量表型筛选、目标液滴分选与细胞回收、液滴内单细胞条形码逆转录测序、以及后续的生物信息学分析与抗体验证。
首先，基于微流控液滴的高通量表型筛选。研究使用小鼠作为模型。研究人员用三种不同的免疫原免疫小鼠：两种可溶性蛋白抗原——破伤风类毒素和多功能酶神经白细胞素/葡萄糖-6-磷酸异构酶，以及过表达人源膜蛋白Tetraspanin-8的鼠源细胞系（作为膜抗原）。免疫后，从小鼠脾脏中提取B细胞并进行富集。关键的第一步是将富集的B细胞与生物检测试剂共同包裹在皮升级的微流控液滴中（每个液滴约40-80皮升）。这是一个新颖的自创技术平台。对于可溶性抗原检测，液滴内包含：单个B细胞、涂覆有抗小鼠κ轻链纳米抗体的超顺磁性纳米颗粒、Alexa Fluor 647标记的抗小鼠IgG Fc抗体（用于检测分泌的IgG）、以及Alexa Fluor 488标记的可溶性抗原（用于检测抗原结合）。液滴在磁场中孵育，使纳米颗粒排列成“磁珠线”，便于荧光信号检测。如果细胞分泌IgG，抗IgG Fc抗体会结合到磁珠线上的IgG，产生红色荧光峰；如果该IgG还能结合可溶性抗原，标记的抗原也会被一同捕获到磁珠线上，产生与红色峰共定位的绿色荧光峰。对于膜抗原检测，液滴内共同包裹：单个B细胞、多个过表达靶膜蛋白Tspan8并用绿色荧光染料标记的报告细胞、以及Alexa Fluor 647标记的抗小鼠IgG Fc抗体。如果B细胞分泌的IgG结合到报告细胞表面的膜抗原上，红色荧光信号就会在绿色报告细胞的位置富集，实现共定位。所有液滴随后以每秒约600个的速度流过一个检测芯片，用多束激光线平行扫描每个液滴，并通过光电倍增管记录荧光的时间轨迹，实时分析荧光信号的分布与共定位情况。
其次，目标液滴分选与细胞回收。基于上一步的实时荧光分析，系统能够自动识别并分选那些同时满足“含有分泌IgG的细胞”且“该IgG展示出特异性抗原结合活性（信号共定位）”标准的液滴。分选是通过介电泳力完成的，速度高达每秒600个液滴。分选出的液滴被收集，并通过破乳步骤回收其中的活细胞。研究证实，回收的细胞存活率高（约79%），并且大多数保持着抗体分泌能力（约56%可经ELISPOT检测分泌IgG）。
第三，液滴内单细胞条形码逆转录测序。这是另一项核心创新技术。从分选液滴中回收的细胞被再次包裹到新的亚纳升级液滴中，这次每个液滴只包含一个目标细胞和一个带有独特DNA条形码的水凝胶微珠。微珠上通过化学合成方法固定了约10^9个带有相同条形码的逆转录引物，这些引物互补于小鼠抗体的重链和轻链恒定区序列。在液滴内，细胞被裂解，微珠上的条形码引物通过紫外光裂解释放，并用于对细胞内的VH和VL信使RNA进行逆转录。因此，来自同一个细胞的VH和VL互补DNA都会带上同一个独特的条形码。所有液滴的cDNA被合并后，通过PCR扩增和下一代测序，即可通过条形码信息追溯并配对出每个原始细胞所表达的天然VH-VL对。这解决了高通量单细胞测序中保留天然抗体配对的难题。
第四，生物信息学分析与抗体验证。研究团队开发了相应的生物信息学流程，对测序数据进行处理，包括：去除低质量序列、根据条形码聚类序列、构建每个细胞的VH-VL配对、纠错生成一致性序列、根据基因同源性将配对抗体聚类为克隆型、分析体细胞高频突变等。最后，为了验证平台发现抗体的功能，研究人员从生成的序列中挑选了一批候选抗体（例如，从破伤风类毒素免疫小鼠中选出42对，从葡萄糖-6-磷酸异构酶免疫小鼠中选出14对，从Tspan8免疫小鼠中选出21对），通过基因合成、克隆到表达载体、在人胚肾细胞中表达为完整的人源化IgG1抗体，并进行了功能验证。
研究的主要结果体现在以下几个方面：
高效、高通量的表型筛选与分选。在针对可溶性抗原的筛选中，从富集的脾细胞中，约2.7%-2.8%的细胞被检测到分泌IgG。其中，针对破伤风类毒素免疫的小鼠，约47%的IgG分泌细胞显示出可检测的抗原结合活性；针对葡萄糖-6-磷酸异构酶免疫的小鼠，约为28%。对于膜抗原Tspan8，平台也成功实现了基于细胞结合活性的分选。每次实验可成功分选出数千至上万个含有目标活性细胞的液滴。
深度且准确的免疫组库测序与分析。平台成功地对分选出的细胞进行了高通量单细胞测序。对于单个免疫小鼠，平台从脾细胞中鉴定出数百至上千个（例如337至1053个）非冗余的VH-VL配对抗体序列，这远超过传统杂交瘤或早期方法所能获得的抗体数量。生物信息学分析揭示了免疫应答的多样性：不同抗原免疫的小鼠，其抗体V基因使用模式存在显著差异；即使是相同抗原免疫的不同小鼠，其V基因使用也显示出一定程度的个体随机性（尤其在破伤风类毒素免疫中更明显）。分析还展示了抗体克隆家族的扩张现象，在针对破伤风类毒素的应答中克隆扩张最为显著，其次是葡萄糖-6-磷酸异构酶和Tspan8。此外，研究发现绝大多数针对可溶性抗原的抗体序列都发生了体细胞高频突变，且突变主要集中在互补决定区，证明了亲和力成熟的发生。通过对来自同一克隆家族的VH和VL序列构建系统发生树，研究还提供了VH和VL协同进化的直接证据，这是深入研究抗体亲和力成熟机制的重要数据。
高成功率的抗体功能验证。平台发现的抗体序列，经表达纯化后，显示出很高的功能性验证成功率。对于可溶性抗原，约93%（39/42的破伤风类毒素抗体和13/14的葡萄糖-6-磷酸异构酶抗体）的重组抗体能够结合其靶抗原，且亲和力较高（破伤风类毒素抗体EC50中位数为0.8 nM；葡萄糖-6-磷酸异构酶抗体KD中位数为0.4 nM）。特别值得注意的是，对于极具挑战性的膜蛋白靶点Tspan8，虽然免疫应答较弱，但平台仍能筛选出特异性的结合抗体，其中14%（3/21）的抗体表现出较强的结合能力，尽管亲和力相对较低（KD值在374 nM至3.64 μM之间）。这证明了Celligo平台在发现针对难治性膜蛋白靶点抗体方面的潜力。
平台的通用性与拓展性。研究还证明，Celligo平台不仅适用于小鼠，也可用于人源抗体的发现。通过体外激活人外周血记忆B细胞，平台从约2300个IgG分泌细胞中，成功获得了约460-900个配对的VH-VL序列，展示了其在挖掘人类抗体库方面的应用潜力。此外，通过简单地更换水凝胶微珠上的引物序列，该平台可以适应不同物种的抗体测序，甚至扩展到单细胞转录组分析。
本研究的结论是，研究团队成功开发并验证了一个名为Celligo的综合性技术平台。该平台将基于微流控液滴的超高通量单细胞表型筛选（检测抗体分泌与抗原结合功能）与液滴内单细胞条形码逆转录测序技术无缝集成，实现了对原始浆细胞和浆母细胞所分泌抗体库的“表型-基因型”耦合深度挖掘。它能够以前所未有的规模和效率，从经过免疫的动物或体外激活的人类细胞中，同时发现功能性抗体并获取其准确的配对序列。
此项研究的意义和价值是多方面的。在科学价值上，它提供了一种强大的工具，可以更全面、更精细地分析针对特定抗原的体液免疫应答，包括抗体库的多样性、克隆选择、扩张动态以及VH-VL协同进化等，从而深化对抗体应答机制的理解。在应用价值上，该平台极大地加速了治疗性或研究用途抗体的发现过程，尤其对于传统方法难以应对的膜蛋白靶点、需要筛选特定功能活性（如细胞信号调控、内吞作用）的抗体、或需要从稀有细胞群体中挖掘抗体的场景，具有革命性的潜力。其高通量、保留天然配对、灵活适应多种检测模式的特点，使其成为抗体药物发现和免疫学研究领域一个极具前景的新平台。
本研究的亮点在于：第一，方法的集成与创新性：创造性地将两种基于液滴的微流控技术（表型筛选分选 + 单细胞条形码测序）结合到一个统一、自动化的流程中，解决了高通量功能筛选与高保真基因型获取难以兼顾的长期难题。第二，技术的突破：其“磁珠线”检测策略提高了信噪比和检测灵敏度；自创的条形码水凝胶微珠及液滴内共包裹技术，实现了高效的单细胞测序样本制备。第三，应用的广泛性与有效性：研究不仅用可溶性抗原验证了平台的超高性能（获得抗体数量和质量均优于传统方法），更成功将其应用于极具挑战的完整细胞膜抗原的抗体筛选，并取得了实质性成果，证明了平台的强大通用性。第四，数据深度与系统性：研究不仅展示了技术流程，还通过系统的生物信息学分析和功能验证，提供了关于免疫组库的深入洞见，使研究超越了单纯的技术演示，具备了深刻的生物学意义。