本文作者是Jane E. Freedman与Joseph M. Miano，代表美国国家心肺血液研究所（National Heart, Lung, and Blood Institute, NHLBI）研讨会参与者撰写。文章发表于《Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology》2017年1月刊，是一篇面向心血管、肺及血液疾病研究者的方法学综述，旨在为长链非编码RNA（long noncoding RNAs, lncRNAs）的理性研究提供基本方向与资源指引。

文章首先指出，lncRNAs的定义是长度超过200个核苷酸、不编码蛋白质的加工转录本，其数量已超过所有蛋白质编码基因。这类转录本常表现出与信使RNA（mRNA）相似的特征，例如依赖RNA聚合酶II转录、具有5’甲基帽、多外显子结构及多聚腺苷酸尾，但它们并不编码稳定且保守的蛋白质。研究者面临的主要困难在于lncRNAs表达水平低、序列保守性差以及功能多变。尽管如此，推动深入研究lncRNAs有两个关键事实：其一，绝大多数疾病相关序列变异位于非编码序列区域，而lncRNAs正位于这些区域；其二，越来越多的证据表明lncRNAs在维持或扰乱细胞稳态中发挥多种作用。因此，阐明心脏、血管、肺和血液中所有相关lncRNAs的功能，对于构建这些组织的完整相互作用组至关重要。

文章主体从多个层面系统介绍了lncRNAs的研究策略。首先是lncRNAs的识别与分类。lncRNAs可细分为增强子RNA（enhancer RNAs）、长基因间非编码RNA（long intervening RNAs）、天然反义RNA（natural antisense RNAs）、正义或反义RNA、假基因以及环状RNA等类型。识别lncRNAs的常用方法是对多聚腺苷酸化或非多聚腺苷酸化RNA进行深度测序，既可以在整体细胞水平进行，也可以在单细胞水平进行，并且可在正常条件或刺激条件下开展。由于大多数lncRNAs序列保守性低，在人类与其他物种之间寻找同源基因较为困难，因此若lncRNAs仅存在于人类中，则无法在小鼠中进行功能缺失研究。不过，短片段序列同源性结合共线性分析仍可为确定lncRNAs直系同源物提供机会。研究者无需进行实验即可在Ensembl和UCSC基因组浏览器中查询已注释的lncRNAs，此外LNCipedia等数据库也提供了丰富的实验与计算数据。许多全基因组关联研究（GWAS）命中位点位于lncRNAs内部或附近，提示许多心血管、肺和血液疾病相关变异可能影响lncRNAs的表达或功能。基因组浏览器还显示大量lncRNAs与蛋白质编码基因紧密相邻或重叠，因此研究者应检查自己感兴趣的蛋白质编码基因周围的基因组区域，以发现邻近的lncRNAs。此类蛋白质编码基因与lncRNAs基因对在遗传功能缺失实验中提出了新的挑战与机遇，而CRISPR系统提供了精准基因组编辑手段，可将lncRNAs的作用与重叠蛋白质编码基因或其他功能性非编码序列的作用区分开来。此外，也可以利用CRISPR创新技术直接靶向lncRNAs，绕开功能性DNA元件或lncRNAs活跃转录的作用。在RNA测序实验中，面对大量以模糊名称（如LOC#、FLJ#、KIAA#等）命名的lncRNAs，研究者可查询多个lncRNAs数据库获取信息，以判断是否值得进一步研究。

其次是lncRNAs的生物信息学分析。利用Scripture等程序可以在参考基因组中从头组装转录单元，其参数包括剪接供体/受体序列及各外显子的相对表达水平。已注释lncRNAs的基本属性可通过多个数据库获取。无论是新发现还是已知的lncRNAs，Ensembl或UCSC浏览器中的染色质免疫沉淀测序数据可揭示染色质特征和转录因子结合位点信息，为理解lncRNAs表达调控提供线索。核糖体图谱分析显示大多数胞质lncRNAs与核糖体机器结合以产生小肽，这些小肽可能参与翻译调控过程并迅速降解。但某些情况下，lncRNAs内部保守的开放阅读框（ORF）可能编码稳定蛋白质并执行重要功能，因此研究者至少应使用ExPASy等程序分析lncRNAs的ORF，并可通过挖掘核糖体图谱数据中的ORF足迹或进行体外转录/翻译实验来验证是否存在稳定肽段。进一步证据可通过质谱分析或利用CRISPR基因组编辑整合表位标签获得。若lncRNAs编码肽段，则可通过定点突变起始密码子来评估该lncRNAs是否同时具有编码与非编码功能。lncRNAs可能含有微小RNA（microRNA）应答元件，并通过作为竞争性内源RNA（competing endogenous RNA, ceRNA）即“海绵”来隔离microRNA从而去抑制靶基因。但这一假说存在争议，其在体内的生理相关性尚未得到充分证实。通过starBase等数据库可预测lncRNAs中的microRNA应答元件。lncRNAs还可与mRNA碱基配对以触发mRNA降解，可通过BLAST查询进行判断。RNAfold或mfold等二级结构预测程序有助于设计PCR引物或siRNA寡核苷酸，并可能为基于结构特征的lncRNAs分类奠定基础。

再次是lncRNAs的表达分析。主要挑战在于从RNA测序筛选中优先选择哪些lncRNAs进行深入研究。在约1000万读段的适度测序深度下，大多数lncRNAs的基础表达水平低于每千碱基转录本每百万映射读段的片段数（FPKM）5。对于筛选出的lncRNAs，通常采用定量RT-PCR在原始细胞或组织中验证其表达水平，并应在多种细胞类型（加或不加激动剂或刺激）和组织类型中进行表达谱分析。由于lncRNAs表达弱，其循环阈值通常≥35。一种假设认为低水平表达可能只是转录噪声，不具备内在生物学信息；但另一方面，低水平表达的lncRNAs可能通过直接或间接的转录调控过程以顺式方式发挥作用，例如隔离关键转录因子、支架染色质重塑因子或形成RNA-DNA三链结构。此外，lncRNAs转录这一行为本身也可能影响局部基因表达。区分这些调控模式可通过精心设计的CRISPR策略实现。由于许多lncRNAs的转录序列注释不完整，定义其全长转录本对于启动子分析或功能获得实验至关重要，可通过5’和3’ cDNA末端快速扩增实现。利用放线菌素D定时实验测定转录本半衰期可提供lncRNAs稳定性信息，该参数在与蛋白质编码基因组成对分析时可能有用。对于低丰度lncRNAs，其准确检测和定量是一大挑战，多数lncRNAs低于组织切片原位杂交的检测限。可通过细胞分级分离结合定量RT-PCR初步判断其亚细胞定位，而定量RNA荧光原位杂交和数字PCR是更强的检测手段。确定lncRNAs定位是阐明其功能的关键步骤：核内lncRNAs常与基因转录、剪接或核结构相关，而胞质lncRNAs功能多样且难以预测，包括调控信号转导通路、其他加工转录本的转录后调控、翻译调控以及蛋白质胞质-核转运的调控。某些高丰度lncRNAs可在血浆或其他体液中检测到，提示其运输可能反映临床相关的（病理）生理过程，许多lncRNAs已被描述为疾病生物标志物，但检测方法的标准化仍是重要挑战。

最后是lncRNAs的功能研究。与具有明确序列特征和作用机制的microRNA不同，lncRNAs的功能很少通过明确的序列规则揭示，一个例外是人类lncRNAs中的Arthrobacter luteus元件介导Staufen介导的mRNA降解。确定lncRNAs亚细胞定位对功能研究至关重要：胞质定位提示应优先研究RNA-RNA或RNA-蛋白质相互作用，而非RNA-DNA相互作用。常见功能研究策略是在细胞中对lncRNAs进行功能缺失（如siRNA敲低）后进行RNA测序。功能获得的转录组分析可能因lncRNAs的非生理水平而难以解释。对于具有临床意义的保守lncRNAs，可利用CRISPR基因组编辑在小鼠中研究其调控、功能或序列变异。双组分CRISPR（Cas9核酸内切酶和sgRNA）可删除lncRNAs的启动子和第一外显子；三组分CRISPR（Cas9、sgRNA加单链寡核苷酸修复模板）可整合多聚腺苷酸化信号以中断转录，产生截短lncRNAs产物。这两种编辑方法可区分加工后的lncRNAs与lncRNAs转录本身在介导基因表达顺式效应中的作用。目前只有Rian这一种lncRNAs在小鼠中通过23 kb缺失被失活，但该方法存在一定问题。最终确定功能需要生化研究揭示lncRNAs与何种大分子相互作用，可用方法包括RNA纯化染色质分离、RNA反义纯化、RNA靶标捕获杂交分析、交联免疫沉淀及核糖核蛋白免疫沉淀等，结合质谱或下一代测序可揭示潜在结合伴侣。例如，通过生物素化正义RNA探针进行核糖核蛋白免疫沉淀结合质谱分析，证明树突状细胞特异性lncRNAs Wfdc21p与STAT3相互作用，通过物理抑制STAT3关键酪氨酸残基的去磷酸化促进其磷酸化；敲低Wfdc21p可减少人和小鼠树突状细胞分化。另一项研究显示lncRNAs NRON与importin beta 1亚基结合，抑制NFAT转录因子家族的胞质-核转运，从而间接影响基因转录程序。目前仅有约50种lncRNAs在心脏、血管和肺中被研究，其中只有少数被证明在病理环境中发挥作用。例如，Mhrt是心脏特异性lncRNAs，在心肌肥厚时被抑制，恢复其表达可预防心力衰竭表型；保守的lincRNA-p21在冠状动脉疾病患者和动脉粥样硬化小鼠模型中表达降低，通过p53激活的正反馈机制减少平滑肌细胞增殖并促进凋亡。这些例子表明lncRNAs在心血管病理中具有重要作用。鉴于其数量庞大、与GWAS命中的相关性日益增加以及多样的作用机制，有必要利用定向全基因组CRISPR-Cas9筛选等手段全面定义每种lncRNAs的表达和功能，以优化心血管、肺和血液疾病的基础与临床研究。

文章的核心价值在于为研究者提供了一套从识别、生物信息学分析、表达检测到功能研究的系统化框架，帮助研究者在一个lncRNAs序列本身难以提供功能线索的情况下，合理设计实验以评估其在特定细胞类型中的潜在作用。