本研究由 Shih-chao Lin、Mei-chun Chen、Shufeng Liu、Victoria M. Callahan、Nicole R. Bracci、Caitlin M. Woodson、Bibha Dahal、Cynthia L. de la Fuente、Chi-chen Lin、Tony T. Wang 以及 Kylene Kehn-Hall 共同完成。研究机构主要包括乔治梅森大学（George Mason University）国家生物防御与传染病中心（National Center for Biodefense and Infectious Diseases）、SRI International 传染病中心（Center of Infectious Diseases），以及台湾中兴大学（National Chung Hsing University）生物医学科学系。通讯作者为 Kylene Kehn-Hall 和 Tony T. Wang。该研究作为一篇短通讯（short communication）发表于 *International Journal of Antimicrobial Agents*，于2018年8月16日投稿，2019年3月16日被接受，并在线发表于2019年。
寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）是一种蚊媒传播的黄病毒（flavivirus），最早于1947年被分离鉴定。该病毒属于黄病毒科（Flaviviridae），可在婴儿中引起严重的先天性畸形，如小头畸形（microcephaly），并与成人中的脑膜脑炎（meningoencephalitis）和格林-巴利综合征（Guillain-Barré syndrome）相关。自2015年巴西爆发以来，寨卡病毒疫情在全球范围内迅速扩散，北美和欧洲均有疫情报道。2016年，世界卫生组织（World Health Organization, WHO）宣布寨卡病毒感染为“国际关注的突发公共卫生事件”。然而，尽管疫情形势严峻，目前仍然没有经 FDA 批准的抗病毒药物或疫苗可供公众使用，因此亟需开发具有抗寨卡病毒活性的补充性和替代性策略。
近年来研究指出，葡萄糖代谢的增强与黄病毒（如登革病毒）的致病性和感染性密切相关。登革病毒感染可导致胰腺炎和糖尿病等糖代谢异常相关疾病。在一例寨卡病毒感染并发脑膜炎的患者中，临床观察到脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）与血液葡萄糖比值升高，这一临床表现可能与病毒引起的脑膜脑炎及其他神经系统损伤的严重程度相关。因此，干扰葡萄糖代谢被认为是一种缓解寨卡病毒感染的可行策略。
根皮素（phloretin）是一种天然存在于苹果树和梨树中的抗氧化剂，属于葡萄糖转运蛋白（glucose transporter, GLUT）抑制剂。根皮素及其衍生物根皮苷（phlorizin）均可竞争性结合葡萄糖载体，从而减少葡萄糖向脑组织的转运。基于上述背景，本研究旨在探索根皮素在体外模型中通过干扰宿主细胞葡萄糖利用稳态来抑制寨卡病毒感染的潜力。
本研究的实验流程可分为抗病毒活性评价、作用机制探索以及葡萄糖依赖性验证三个主要部分。研究对象包括非洲绿猴肾细胞（Vero cells）、人星形胶质瘤细胞（U87MG cells）和人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）。实验使用了两种寨卡病毒株：非洲基因型 MR766 和波多黎各基因型 PRVABC59，感染复数（multiplicity of infection, MOI）均为0.1。
在抗病毒活性评价阶段，研究者首先以不同浓度的根皮素预处理 Vero 细胞1小时，随后进行寨卡病毒感染。感染后，将接种物替换为含有新鲜根皮素的培养基，并持续培养至实验终点。通过 CellTiter-Glo® 发光法检测细胞活力，该法通过定量代谢活跃细胞中的 ATP 含量来反映细胞存活状态。同时，通过空斑实验（plaque assay）测定感染后48小时培养上清中的病毒滴度。此外，研究者还利用抗黄病毒包膜糖蛋白抗体（clone D1-4G2-4-15）进行免疫荧光染色，在共聚焦显微镜下观察细胞内寨卡病毒蛋白的表达水平。为确认根皮素的抗病毒活性并非局限于 Vero 细胞，研究者还在 U87MG 和 HUVEC 细胞中进行了细胞活力和病毒滴度检测。
在作用机制探索阶段，研究者开展了时间添加实验（time of addition analysis），分别在感染前1小时（pre-treat）、感染同时（co-treat）和感染后1小时（post-treat）加入根皮素，以确定其发挥抗病毒作用的关键时间窗口。此外，还在感染后不同时间点（0、1、2、4、6、8、12、24小时）加入100 μM根皮素，观察延迟给药对病毒增殖的影响。为深入分析根皮素对病毒 RNA 复制的影响，研究者利用逆转录定量 PCR（reverse transcription-quantitative PCR, RT-qPCR）检测了培养上清和细胞裂解液中的病毒 RNA 水平。为探究根皮素对凋亡通路的影响，研究者使用 Caspase-Glo® 3⁄7 试剂盒检测了 caspase-3 和 caspase-7 的活性。同时，通过 Western blot 方法检测了 Akt 蛋白在 Ser473 和 Thr308 位点的磷酸化水平，以及下游蛋白 mTOR 的磷酸化水平和自噬相关蛋白 LC3B 的表达情况。
在葡萄糖依赖性验证阶段，研究者对 Vero 细胞进行过夜血清饥饿以耗尽细胞内残余葡萄糖，随后分别加入含有葡萄糖、谷氨酰胺或10 μM 2-脱氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose, 2DG，一种己糖激酶抑制剂）的2%胎牛血清培养基，并联合不同浓度的根皮素处理。感染后24小时测定病毒滴度。此外，研究者还使用去铁胺（deferoxamine, DFO）甲磺酸盐模拟细胞低氧状态，以诱导 GLUT1 表达上调，从而验证葡萄糖利用对寨卡病毒增殖的重要性。最后，研究者还比较了根皮素衍生物根皮苷（phlorizin，即根皮素-2’-O-葡萄糖苷，一种钠-葡萄糖共转运蛋白 SGLT1 和 SGLT2 的抑制剂）的抗寨卡病毒活性。
在抗病毒活性评价方面，根皮素展现出显著的抗寨卡病毒效果。在 MOI 为0.1的感染条件下，根皮素在72小时感染后（hours post-infection, hpi）能够恢复 MR766 感染细胞高达60%的细胞活力，以及 PRVABC59 感染细胞高达80%的细胞活力。根皮素对 MR766 和 PRVABC59 的半数有效浓度（50% effective concentration, EC50）分别为22.85 μM和9.312 μM。在高达100 μM的浓度范围内，根皮素对 Vero 细胞几乎没有毒性，半数细胞毒性浓度（50% cytotoxic concentration, CC50）大于100 μM，表明其抑制效果并非源于细胞毒性。这一保护作用可持续至96小时感染后。空斑实验结果显示，根皮素以剂量依赖性方式显著抑制 MR766 和 PRVABC59 两种病毒株的感染性滴度，在100 μM浓度下可实现约3个对数级的病毒滴度下降。免疫荧光染色结果与病毒滴度实验结果一致，证实了根皮素对病毒蛋白表达的抑制作用。在 U87MG 细胞中，根皮素同样表现出降低寨卡病毒诱导的细胞死亡和病毒滴度的效果，且细胞毒性极轻微。但在 HUVEC 细胞中，根皮素未能有效减少寨卡病毒诱导的细胞死亡，虽然高浓度下病毒滴度有所下降，但这可能归因于该浓度下观察到的细胞死亡。
在作用机制探索方面，时间添加实验表明，无论根皮素是在感染前、感染同时还是感染后加入，均能剂量依赖性地提高细胞活力，且这一效果不受病毒株和时间点影响。延迟给药实验显示，即使在感染后24小时加入根皮素，仍能抑制寨卡病毒增殖，但效果不如早期给药。RT-qPCR 结果显示，100 μM根皮素处理后，细胞内寨卡病毒 RNA 水平降低约2个对数级，胞外 RNA 水平降低约2.5至3个对数级，提示根皮素可能影响病毒复制的多个阶段，包括 RNA 合成以及病毒组装或释放等后期阶段。凋亡通路分析显示，寨卡病毒感染导致 caspase-3 和 caspase-7 活性显著升高，而根皮素处理在48小时感染后剂量依赖性地抑制了这两种 caspase 的活性。Western blot 结果显示，根皮素剂量依赖性地降低了 Akt 在 Ser473 和 Thr308 位点的磷酸化水平，同时下游蛋白 mTOR 的磷酸化水平也随之降低，证实 Akt/mTOR 通路可能是根皮素发挥抗寨卡病毒作用的通路之一。值得注意的是，自噬相关蛋白 LC3B 的表达在寨卡病毒感染和根皮素处理后均未发生变化，提示自噬通路可能不参与这一抗病毒机制。
在葡萄糖依赖性验证方面，血清饥饿后的 Vero 细胞在无葡萄糖但补充谷氨酰胺的培养基中培养时，寨卡病毒滴度下降约2个对数级；而加入2DG或根皮素后，病毒滴度的下降更为显著。根皮素对病毒滴度的抑制作用呈剂量依赖性，进一步证明葡萄糖是寨卡病毒增殖所必需的，且根皮素能够干扰这一过程。去铁胺处理实验中，随着去铁胺浓度升高，寨卡病毒滴度也剂量依赖性地增加，这与去铁胺诱导 GLUT1 表达升高的作用相一致，提示 GLUT1 表达水平与寨卡病毒增殖能力呈正相关。在根皮苷的比较实验中，根皮苷对两种寨卡病毒株仅表现出有限的细胞保护作用，且伴有轻微细胞毒性。虽然根皮苷是根皮素的衍生物，但其抗寨卡病毒活性显著低于根皮素。研究者推测，根皮苷分子中特有的葡萄糖苷基团改变了其底物特异性，使其偏向抑制钠离子依赖性葡萄糖转运蛋白（如 SGLT1），而根皮素则抑制钠离子非依赖性葡萄糖转运蛋白（如 GLUT1）。
本研究首次系统证明了根皮素对寨卡病毒的抗病毒活性，且该活性不具有病毒株特异性，对非洲基因型 MR766 和波多黎各基因型 PRVABC59 均有效。研究结果表明，根皮素的抗病毒机制可能涉及抑制病毒复制、调节抗凋亡活性（表现为下调 caspase-3 和 caspase-7 活性）以及干扰 Akt/mTOR 信号通路。更重要的是，本研究通过多种实验手段证实了葡萄糖代谢对寨卡病毒在宿主细胞中增殖的必要性，为根皮素的抗寨卡病毒活性提供了合理的机制解释。
从科学价值来看，本研究揭示了葡萄糖利用通路在寨卡病毒生命周期中的重要性，为理解黄病毒与宿主代谢之间的相互作用提供了新的实验证据。从应用价值来看，根皮素作为一种天然来源的葡萄糖转运蛋白抑制剂，具有良好的安全性特征（CC50大于100 μM），其抗寨卡病毒活性为开发新型抗病毒药物提供了有前景的先导化合物基础。研究还提示，GLUT1 可能是一个潜在的抗寨卡病毒药物靶点。
本研究的亮点主要体现在以下几个方面：首先，研究首次证实了根皮素这一天然黄酮类化合物对寨卡病毒具有显著的抗病毒活性，且对两种不同基因型的病毒株均有效。其次，研究从葡萄糖代谢的角度阐明了寨卡病毒对宿主细胞能量代谢的依赖性，为“代谢-病毒互作”这一新兴研究方向提供了有力证据。第三，研究将 Akt/mTOR 信号通路与寨卡病毒增殖联系起来，并证实根皮素可通过下调该通路的磷酸化水平来抑制病毒。第四，研究比较了根皮素与其衍生物根皮苷的抗病毒活性差异，初步揭示了葡萄糖转运蛋白亚型选择性在抗病毒活性中的重要性，为后续药物设计提供了结构-活性关系线索。第五，研究采用了多种互补的实验手段，包括细胞活力检测、病毒空斑实验、免疫荧光、RT-qPCR、caspase 活性检测和 Western blot 等，从多个层面验证了根皮素的抗病毒效果及其潜在机制，实验设计严谨，证据链条完整。