本研究由Ning Song（免疫疾病研究中心，中国科学院上海药物研究所；中国科学院大学）、Wen Zheng（CADD计算机辅助蛋白质设计模拟器，湖北远大生物技术有限公司）、Bin Song（上海交通大学医学院上海病毒学研究所）和Jie Zheng*（通讯作者，免疫疾病研究中心，中国科学院上海药物研究所；中国科学院大学）共同完成。该研究于2024年发表于期刊ChemBioChem，文章具体上线时间为2024年6月21日。
此项研究的学术背景聚焦于冠状病毒（Coronavirus, CoV）感染的治疗靶点发现。冠状病毒，特别是严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）以及引发COVID-19的SARS-CoV-2，已对人类健康造成严重威胁。冠状病毒3-糜蛋白酶样蛋白酶（3-chymotrypsin-like protease, 3CLpro或Mpro）在病毒复制和成熟过程中起着至关重要的作用，其必须形成同源二聚体构象才能发挥完整的酶活性。因此，靶向3CLpro二聚化的变构调节机制，而非直接作用于其催化活性中心，成为一种极具潜力的抗病毒药物研发新策略。然而，关于小分子化合物如何变构调控3CLpro二聚化的详细分子机制仍不明确。本研究的核心目标是：利用氢氘交换质谱（Hydrogen/Deuterium Exchange coupled with Mass Spectrometry, HDX-MS）技术，结合生物化学与计算模拟方法，系统探究3CLpro的二聚化变构调控机制，并评估一种已知的变构抑制剂——枸橼酸铋钾（Gastrodenol, CBS）——对不同冠状病毒3CLpro的抑制作用及其广谱抗病毒潜力。
研究的详细工作流程包含多个紧密关联的实验与分析步骤。首先，研究团队构建并纯化了多种冠状病毒的3CLpro重组蛋白，包括7种β-冠状病毒（SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、WIV1、BtCoV-HKU9、MHV、HCoV-OC43）、1种α-冠状病毒（HCoV-229E）、1种γ-冠状病毒（IBV）和1种δ-冠状病毒（PDCoV）。特别地，为了探究N端结构域（N-finger，对二聚化至关重要）的作用，他们制备了在N端或C端带有FLAG标签的3CLpro变体（Flag-3CLpro和3CLpro-Flag）。此外，还构建了SARS-CoV-2 3CLpro的多个点突变体（如R4A、E290A、R298A、P9T、C145A），以验证关键残基对二聚化和构象的影响。研究对象总计涉及10种不同冠状病毒的野生型及修饰型3CLpro蛋白。
研究的核心实验方法是HDX-MS，这是一种用于探测蛋白质构象动态和蛋白质-配体相互作用的强大技术。其基本原理是：蛋白质骨架酰胺氢（NH）与溶剂中的氘（D）发生交换的速率高度依赖于其溶剂可及性和氢键形成情况；构象变化或配体结合会改变局部氢交换动力学，从而通过质谱检测到的氘掺入差异反映出来。研究团队对上述所有3CLpro蛋白样品，分别在有无Gastrodenol抑制剂存在的条件下，进行了平行HDX-MS实验。具体流程包括：将蛋白样品置于氘代缓冲液中孵育不同时间，通过快速酸化与低温液氮淬灭交换反应，随后进行酶解（通常使用胃蛋白酶）和液相色谱-质谱联用分析，最后通过专用软件（如HDX Workbench）计算不同肽段的氘掺入百分比（D%）及其变化（ΔD%）。此外，研究还采用了尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC）来直接分析蛋白质的寡聚状态（单体或二聚体），以验证HDX-MS观测到的构象变化是否确实对应于二聚体的解离。为了深入理解Gastrodenol的作用机制，他们还进行了分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟。模拟以分子对接得到的3CLpro-Gastrodenol复合物结构为起点，进行了100纳秒的全原子MD模拟，分析配体结合前后蛋白质的均方根偏差（RMSD）、关键氢键距离等动态参数，从原子层面阐释构象稳定性的变化。
研究的主要结果环环相扣，逻辑清晰地揭示了变构调控机制。第一部分的实验聚焦于N端FLAG标签对3CLpro的影响。HDX-MS结果显示，与野生型或无标签蛋白相比，将FLAG标签直接连在SARS-CoV-2 3CLpro的N端（Flag-3CLpro）会导致整个蛋白，尤其是在N-finger区域（第1-7位氨基酸）和二聚体界面区域，氘交换速率显著增加，表明这些区域变得更为开放、动态性增强。而C端标签的影响则小得多。SEC分析证实，Flag-3CLpro主要呈现单峰且洗脱体积更大，对应于单体构象；而野生型和C端标签蛋白主要呈二聚体峰。这表明，N端标签通过干扰关键的N-finger结构，破坏了维持二聚体界面的相互作用，从而驱动二聚体向单体转变。这一现象在扩展到其他冠状病毒（如SARS-CoV、MERS-CoV、WIV1、HCoV-OC43、HCoV-229E）时也被观察到，尽管程度不同，说明N-finger在β-冠状病毒乃至其他属冠状病毒3CLpro二聚化中的关键作用是保守的，但具体结构的微小差异导致了对外界干扰的敏感性不同。
第二部分研究了SARS-CoV-2 3CLpro关键残基突变体的构象。HDX-MS和SEC分析显示，破坏二聚体盐桥的突变体E290A和R298A，以及已知能部分形成单体的突变体P9T，都表现出显著升高的氘交换速率和单体SEC峰，这与它们二聚体稳定性降低的预期一致。而催化残基突变体C145A虽然失去酶活，但其HDX动力学和SEC图谱与野生型相似，说明其仍能维持二聚体构象，酶活性和二聚化是可以分离的。这些结果进一步证实了：单体形式的3CLpro具有更高的构象动态性（反映为更高的HDX速率），HDX-MS是监测3CLpro单体-二聚体平衡变化的灵敏工具。
第三部分是研究的核心，系统评估了变构抑制剂Gastrodenol对十种不同冠状病毒3CLpro的影响。HDX-MS图谱分析得出了两个层面的关键发现。首先，在结合区域层面： Gastrodenol与大多数β-冠状病毒的3CLpro（特别是SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、WIV1）结合后，在C端结构域（CTD）的特定区域（如第213-218位氨基酸区域）显示出氘交换保护效应（即氘掺入减少），这表明这些区域因配体结合而变得更为刚性或溶剂可及性降低，很可能就是Gastrodenol的直接变构结合位点。其次，也是更重要的发现，在全局构象影响层面： Gastrodenol的结合导致了这些β-冠状病毒3CLpro蛋白在多个远端区域（尤其是连接结构域II和III的发夹环区域，如第105-115位氨基酸区域）的氘交换速率显著增加，意味着整个蛋白结构去稳定化，变得更加松散和动态。结合对已知3CLpro构象状态的理解，研究者推断，对于SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV和WIV1，Gastrodenol可能诱导其3CLpro从紧密的二聚体状态转变为伸展的单体状态（extended monomeric state）；而对于其他β-冠状病毒如BtCoV-HKU9、MHV和HCoV-OC43，则可能转变为紧凑的单体状态（compact monomeric state）。相比之下，α-冠状病毒（HCoV-229E）、γ-冠状病毒（IBV）和δ-冠状病毒（PDCoV）的3CLpro在结合Gastrodenol后，并未出现显著的全局氘交换增加，暗示它们可能仍保持二聚体状态，对Gastrodenol不敏感。作为对照，共价抑制剂Nirmatrelvir的结合则普遍导致3CLpro的氘交换减少，体现了其通过占据活性口袋稳定局部构象的不同作用模式。此外，通过比较Gastrodenol与其不含铋离子的辅助组分（如枸橼酸钾）的HDX效应，研究发现仅含铋（III）离子的化合物才能引发显著的构象去稳定化，明确了铋（III）离子在变构抑制中的核心作用。
第四部分的分子动力学模拟为上述HDX-MS观察提供了原子水平的机理解释。模拟结果显示，在结合Gastrodenol后，SARS-CoV-2等敏感β-冠状病毒3CLpro的整体RMSD值显著高于其apo状态，表明蛋白整体柔性增加、更不稳定。关键的是，对二聚体界面氢键网络的分析发现，Gastrodenol的结合削弱了原聚体间的关键相互作用力，例如N-finger上的Arg4与另一原聚体上的Glu290之间的盐桥距离增大，以及Ser1与Glu166之间的氢键距离增加。这种界面相互作用的破坏直接导致了二聚体的解离。而对于不敏感的HCoV-229E，MD模拟则未显示界面氢键有显著变化，解释了其为何对Gastrodenol无反应。
本研究得出的结论是明确且具有重要意义的。研究表明，3CLpro的二聚化过程可以通过其N-finger或变构位点进行有效调控。利用HDX-MS这一灵敏工具，研究直观地展示了配体结合或突变引起的蛋白质构象动态变化。更重要的是，研究系统性地证明，变构抑制剂Gastrodenol能够选择性地破坏大多数β-冠状病毒3CLpro的二聚体界面，诱导其从功能性的二聚体向非活性的单体状态转变，且这种效应在SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV和WIV1中最为显著。分子动力学模拟从原子层面揭示了其作用机制在于削弱二聚体界面氢键网络。这些发现共同表明，Gastrodenol具有成为广谱抗β-冠状病毒药物的潜力。
本研究的亮点突出体现在以下几个方面：1. 研究方法的创新性应用： 将HDX-MS技术系统性地应用于冠状病毒3CLpro变构调控研究，实现了对蛋白质构象动态和寡聚状态变化的高分辨率、全局性监测，为理解变构抑制机制提供了直接、动态的实验证据。2. 研究对象的系统性： 并非局限于单一病毒（如SARS-CoV-2），而是涵盖了四个属共十种冠状病毒的3CLpro，进行了全面的比较研究，从而得出了关于Gastrodenol作用谱和选择性的重要结论。3. 多技术联用的深度解析： 研究整合了HDX-MS（构象动态）、SEC（寡聚状态）、点突变（功能验证）和MD模拟（原子机制），构成了一个多层次、相互印证的技术体系，使结论非常扎实。4. 明确的转化医学价值： 研究不仅阐明了变构抑制的分子机制，更重要的是评估并确认了一种已上市药物（枸橼酸铋钾）作为广谱抗β-冠状病毒候选药物的潜力，为应对当前及未来可能出现的冠状病毒疫情提供了新的策略和现成的候选化合物。
其他有价值的发现还包括：研究揭示了不同冠状病毒3CLpro虽然结构高度相似，但其构象动态（Apo状态的HDX图谱）和对变构干扰（如N端标签、Gastrodenol）的响应存在显著差异，这反映了病毒进化中的细微适应，也为设计特异性更强的抑制剂提供了依据。此外，通过对比Gastrodenol与共价抑制剂Nirmatrelvir的作用模式，研究清晰地展示了变构抑制与活性位点抑制在构象效应上的根本区别，加深了对不同抑制策略的理解。这项工作为基于3CLpro二聚化界面的变构药物设计提供了重要的理论依据和实验基础。