这篇文档属于类型a，即报告了一项原创性研究。以下是针对该研究的学术报告：

主要作者及研究机构

本研究由俄罗斯科学院理论与实验生物物理研究所（Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Sciences）的Natalia V. Belosludtseva领衔，合作单位包括马里国立大学（Mari State University）、俄罗斯科学院普通物理研究所（Prokhorov General Physics Institute of the Russian Academy of Sciences）、莫斯科国立大学医学研究与教育学院（Medical Research and Education Institute, Lomonosov Moscow State University）以及中国青岛健康与康复科学大学（University of Health and Rehabilitation Sciences, Qingdao）。研究于2024年9月15日发表在期刊《Biomolecules》（2024年第14卷第1159期）。

学术背景

研究聚焦于高脂血症（hyperlipidemia）在糖尿病等代谢性疾病中导致血管病变的机制，尤其是线粒体功能障碍（mitochondrial dysfunction）的作用。高脂血症会引发线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore, mPTP）的开放、膜电位下降及活性氧（reactive oxygen species, ROS）过量产生，但具体机制尚不明确。本研究旨在探讨腺苷酸转运体（adenine nucleotide translocator, ANT）的两种调节剂——bongkrekic acid（BA）（mPTP抑制剂）和carboxyatractyloside（CAT）（mPTP激活剂）——对棕榈酸（palmitate, PA）诱导的线粒体功能障碍和脂毒性的影响，以揭示ANT在代谢应激中的调控作用。

研究流程

研究分为以下主要步骤：

1. 细胞模型构建

   • 研究对象：
     
     • 小鼠原代肺血管内皮细胞（primary mouse lung endothelial cells），通过抗CD31抗体磁珠分选获得，培养7-10代后用于实验。
       
     • HEK293T细胞系（通过CRISPR/Cas9技术敲低ANT2基因，编辑效率约35%，蛋白表达降低60%）。
       
   • 脂毒性模型：内皮细胞和HEK293T细胞分别用0.75 mM和0.5 mM棕榈酸-牛血清白蛋白（PA/BSA）复合物处理48小时或6天，模拟高脂环境。
     

2. 药物干预

   • BA（25 μM）和CAT（10 μM）与PA同时加入培养基，每48小时更换一次以维持浓度。对照组使用等量DMSO溶剂。
     

3. 功能检测

   • 细胞存活率：Hoechst 33342和碘化丙啶（propidium iodide）双染色，通过荧光显微镜计数死/活细胞比例。
     
   • 线粒体膜电位（Δψ）：四甲基罗丹明甲酯（TMRM）荧光探针标记，FCCP（线粒体解偶联剂）诱导去极化后定量荧光衰减。
     
   • mPTP开放活性：Calcein-AM与CoCl₂共孵育，通过线粒体内Calcein荧光淬灭程度评估mPTP开放。
     
   • ROS水平：
     
     • 总ROS：DCFH-DA探针检测细胞质ROS。
       
     • 线粒体超氧化物：MitoSOX Red荧光探针标记。
       
   • 线粒体-溶酶体共定位：Mitotracker DeepRed（线粒体）与LysoTracker Green（溶酶体）双染色，共聚焦显微镜成像分析共定位面积占比。
     
   • Western blot：检测HEK293T细胞中ANT2蛋白表达水平。
     

4. 数据分析

   • 使用GraphPad Prism 8.4进行单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验，数据以均值±标准误表示。
     

主要结果

1. BA缓解脂毒性，CAT加剧细胞死亡

   • PA处理6天使内皮细胞存活率下降80%，BA预处理将存活率提升至31%，而CAT进一步降低存活率（图1b）。
     
   • HEK293T细胞中，ANT2敲低使PA诱导的细胞死亡更显著（存活率从37%降至25%）（图6b）。
     

2. BA抑制mPTP开放和ROS生成

   • PA处理导致线粒体ROS（MitoSOX信号）增加1.6倍，BA显著抑制此现象，而CAT无改善作用（图2）。
     
   • BA减少Calcein荧光淬灭（抑制mPTP开放），CAT则促进mPTP开放（图4）。
     

3. 线粒体-溶酶体共定位与膜电位变化

   • PA增加线粒体与溶酶体共定位（提示线粒体自噬增强），BA降低共定位水平，CAT无影响（图5）。
     
   • BA部分恢复PA诱导的线粒体膜电位下降，CAT仅轻微改善（图3）。
     

4. ANT2敲低的负面影响

   • ANT2敲低HEK293T细胞在基础状态下ROS即升高，PA处理后进一步加剧（图7a），且mPTP开放增加（图8），表明ANT2缺失直接导致氧化应激和线粒体损伤。
     

结论与意义

本研究证实：
1. mPTP开放是PA诱导脂毒性的核心事件，BA通过抑制ANT介导的mPTP开放，减轻线粒体功能障碍和细胞死亡；而CAT或ANT2敲低则加重损伤。
2. 能量代谢重编程（如ANT抑制导致的氧化磷酸化抑制）并非保护机制，靶向mPTP的干预更具治疗潜力。
3. 科学价值：为糖尿病血管并发症提供了新的线粒体靶点（ANT/mPTP），但BA的毒性限制了其直接临床应用，需进一步优化药物设计。

研究亮点

1. 创新模型：结合原代内皮细胞和基因编辑HEK293T细胞，多角度验证ANT2的功能。
   
2. 机制深度：首次阐明BA/CAT通过调控ANT构象（“M”态与“C”态）影响mPTP开放的差异效应。
   
3. 转化意义：为开发抗脂毒性药物提供了理论依据，提示需平衡mPTP抑制与线粒体功能维持。
   

其他价值

研究补充数据（如线粒体钙保留能力、呼吸链活性检测）进一步支持BA/CAT对线粒体功能的调控作用（图S1），为后续研究提供了方法学参考。

（注：文中图表编号与原文一致，如“图1b”指原文Figure 1b；专业术语如“mPTP”首次出现时标注英文全称。）