本文发表于 *Nature*，第一作者为 Zi-Qi Li，通讯作者为 Frances H. Arnold（加州理工学院）与 Peng Liu（匹兹堡大学）。该研究报道了一种通过血红素蛋白（haemprotein）催化的氮杂环丙烷化/扩环串联反应，从未活化烯烃直接不对称合成手性噁唑烷酮的新方法。

手性噁唑烷酮（chiral oxazolidinones）是一类在不对称合成和药物发现中具有重要地位的含氮氧杂环化合物，尤其是一类5-(S)-氨甲基噁唑烷酮，是靶向多重耐药和广泛耐药结核分枝杆菌的新一代抗生素核心骨架。传统合成策略主要依赖“手性池”（chiral pool）路线，即需要光学纯氨基醇作为关键中间体。虽然已有多种方法可构建4位（α-氮侧）手性中心，但构建5位（α-氧侧）手性中心的方法仍相对有限，常需通过不对称环氧化或水解动力学拆分（HKR）获得手性环氧化物再衍生化，步骤冗长、原料昂贵且原子经济性差。

为解决这一问题，作者设想从含有氨基甲酸酯羰基源的烯丙胺衍生物出发，利用血红素蛋白催化的不对称氮杂环丙烷化（aziridination）在末端烯烃上形成氮杂环丙烷中间体，随后发生分子内5-exo-tet环化扩环，直接构建噁唑烷酮骨架。这一思路的关键挑战在于，此前血红素蛋白催化的氮烯转移（nitrene transfer）反应主要局限于苯乙烯等活化烯烃，而实现未活化烯烃的不对称氮杂环丙烷化，则需同时避免烯丙位C–H胺化和氨基羟基化等竞争副反应。

作者选择了叔丁基烯丙基(苯基)氨基甲酸酯（1a）作为模型底物，以O-新戊酰羟胺三氟甲磺酸盐（2a）为胺化试剂。通过对一系列工程化血红素蛋白进行筛选，发现来自 Aeropyrum pernix 的原球蛋白（protoglobin, ApPgb）变体ApPgb-OxaZS-G0-5401具有初步活性，但产率仅为0.9%，对映选择性为67%。随后，作者以该变体为起点开展定向进化（directed evolution），综合采用位点饱和突变（SSM）、易错PCR（ePCR）随机突变和交错延伸过程（StEP）重组等策略。经过多轮进化，关键突变A59V的引入使对映选择性从53%大幅提高至94%。最终获得的变体ApPgb-OxaZS-G8-5409在优化条件下可实现92%产率和97% ee。条件优化中，使用澄清裂解液替代全细胞催化剂显著提高了反应效率，这归因于减少传质限制。

在底物适用范围研究中，作者系统考察了N-芳基取代的烯丙基氨基甲酸酯。对位给电子基团通常给出更高对映选择性，而对位吸电子基团则选择性降低。多种官能团如酯基、卤素、烷基、芳基等均被考察。含氟取代的底物（3e、3n、3o、3p）获得了中等到良好的产率和优异的对映选择性。对位卤代底物虽能获得产物，但对映选择性很低，限制了后续通过交叉偶联进行后期多样化的策略。作者还将该方法应用于药物相关噁唑烷酮类似物的直接合成，包括利伐沙班（rivaroxaban）中间体3u、利奈唑胺（linezolid）一步前体3v、临床I期候选药物TBI233的前体3w等。其中3w的ee>99%。然而，含硫吗啉的舒他唑胺（sutezolid）前体3x在ApPgb-OxaZS-G8-5409催化下几乎无活性，作者推测是硫原子的竞争性S–N键形成导致副反应。

为恢复对3x的活性，作者开展了靶向进化。通过重新审视进化轨迹中的突变，发现R90G突变对提高3x活性有关键作用。以包含R90G和N106D突变的变体为起点，经过三轮进化获得ApPgb-StZS-G4-5413，可将3x的产率提高至24%（全细胞条件下7%），ee为99%。分子动力学模拟显示，R90G突变破坏了第90位精氨酸与第57位天冬氨酸之间的氢键，增加了底物通道的柔性，减少了空间位阻，从而限制了非目标反应途径。利用该变体，作者还高效合成了舒他唑胺二氧化物前体3y（64%产率）和临床候选药物MK-7762的前体3z（57%产率，>99% ee）。

在机制研究方面，作者通过对照实验排除了氨基羟基化/转氨甲酰化级联路径。密度泛函理论（DFT）计算支持以下机理：Fe–氮烯物种首先对未活化C=C键加成，经过渡态TS1形成二级烷基自由基；随后通过能垒仅3.5 kcal/mol的自由基回弹形成氮杂环丙烷中间体；氮杂环丙烷质子化后形成氮杂环丙鎓离子，进而发生分子内立体翻转的SN2反应，扩环生成噁唑烷酮。分子动力学模拟进一步揭示了A59V突变提高对映选择性的原因：缬氨酸残基与底物的N-Boc和苯基之间产生更大的立体排斥，使底物更靠近血红素辅因子，增强了酶对氮杂环丙烷化步骤的立体控制。

该研究的主要价值在于：首次实现了血红素蛋白催化的未活化烯烃不对称氮杂环丙烷化，将生物催化氮烯转移反应从活化烯烃扩展至未活化烯烃；提供了一条从简单非手性烯烃出发直接构建5-(S)-氨甲基噁唑烷酮的高效、高选择性路线，避免了手性池原料和多步保护基操作；为重要抗生素骨架的绿色合成提供了新范式，同时通过定向进化和计算分析阐明了关键突变的作用机制。该工作还展示了靶向进化在解决特定底物活性缺失问题上的潜力，为未来构建含季碳手性中心的噁唑烷酮类药物奠定了方法学基础。实验方法上，作者采用全细胞或澄清裂解液催化、厌氧条件下室温反应，并通过手性液相色谱-质谱联用测定对映选择性；计算方面结合DFT和经典分子动力学模拟，为理解反应机理和选择性起源提供了原子层面的见解。