本研究由Taylor B. Engdahl、Natalia A. Kuzmina、Adam J. Ronk等人完成，主要作者来自Vanderbilt University Medical Center和University of Texas Medical Branch。通讯作者为Alexander Bukreyev和James E. Crowe, Jr.。该研究于2021年5月4日发表在《Cell Reports》期刊上，文章标题为“Broad and potently neutralizing monoclonal antibodies isolated from human survivors of New World hantavirus infection”。

汉坦病毒（hantavirus）属于布尼亚病毒目（order Bunyavirales），通过啮齿动物传播给人类，在全球多地呈地方性流行。根据地理分布和致病特点，汉坦病毒分为新世界汉坦病毒（New World hantaviruses, NWHs）和旧世界汉坦病毒（Old World hantaviruses, OWHs）。新世界汉坦病毒包括安第斯病毒（Andes virus, ANDV）和辛诺柏病毒（Sin Nombre virus, SNV），引起汉坦病毒心肺综合征（hantavirus cardiopulmonary syndrome, HCPS），病死率可高达40%。旧世界汉坦病毒包括汉滩病毒（Hantaan virus, HTNV）、普马拉病毒（Puumala virus, PUUV）等，主要引起肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）。目前尚无美国食品药品监督管理局（FDA）批准的针对汉坦病毒感染的生物制品或治疗药物。已有研究表明，患者血清中高中和抗体滴度与NWH感染后存活率升高相关，但人类对NWH的中和抗体应答的分子和遗传基础尚不清楚。该研究的目的是从SNV和ANDV感染康复者体内分离人源单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs），系统表征其中和效力和交叉反应性，并评估其在动物模型中的治疗效果。

研究团队从三名曾感染SNV的康复者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）中分离出20株SNV反应性mAbs，从一名曾感染ANDV的供者中分离出16株ANDV反应性mAbs。所有mAbs均通过B细胞杂交瘤技术（B cell hybridoma method）制备。首先，研究者在Expi293F细胞表面表达SNV或ANDV糖蛋白，通过流式细胞术筛选能结合这些糖蛋白的B细胞。随后，利用水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV）假病毒系统在生物安全二级（BSL-2）条件下筛选mAbs的中和活性。该假病毒系统去除了VSV自身的糖蛋白基因，替换为绿色荧光蛋白（GFP）基因，并以NWH糖蛋白Gn和Gc进行假型化，形成复制缺陷型病毒颗粒。对假病毒具有中和活性的mAbs进一步在生物安全三级（BSL-3）条件下用空斑减少中和试验（plaque reduction neutralization test, PRNT）检测其对真实SNV毒株SN77734和ANDV毒株Chile-9717869的中和能力。研究还通过流式细胞术检测了mAbs对ANDV、SNV及四种OWHs（PUUV、DOBV、HTNV、SEOV）糖蛋白的结合能力，并用相应的VSV假病毒和真实病毒检测了交叉中和活性。为探究中和机制，研究者进行了受体阻断试验，利用可溶性原钙粘蛋白-1（protocadherin-1, PCDH-1）的胞外结构域EC-1（sEC-1）检测mAbs是否阻断病毒与受体的结合；还进行了细胞-细胞融合抑制试验，将表达ANDV或SNV Gn/Gc的Vero细胞暴露于低pH环境诱导融合，评估mAbs对融合的抑制作用。此外，研究者通过基于流式细胞术的竞争结合试验对抗原位点进行分组，将mAbs分为八个主要抗原位点（A1、A2、B、C1、C2、D、E、F），并检测了mAbs对单独表达的Gn或重组Gc蛋白的结合能力。最后，选取五株具有代表性的mAbs（rsnv-30、rsnv-24、rsnv-53、randv-5、randv-44）在叙利亚金黄地鼠（Syrian hamster）致死性ANDV感染模型中评估暴露后治疗效果。地鼠通过肌肉注射200 PFU ANDV，在感染后第3天和第8天腹腔注射5 mg/kg的mAb，以登革病毒特异性抗体rDENV 2D22作为同型对照。

结果显示，在SNV反应性mAbs中，只有SNV-42具有超强中和活性（IC50<10 ng/ml），SNV-53具有强中和活性（IC50 10–100 ng/ml），另有四株mAbs具有较弱的中和活性，其余无中和活性。大多数SNV反应性mAbs对ANDV糖蛋白具有交叉反应，并能在假病毒水平中和ANDV，其中七株对真实ANDV具有中和活性。相比之下，ANDV反应性mAbs大多为ANDV特异性，六株显示超强中和活性，三株强中和活性，四株较弱中和活性；仅ANDV-44对真实SNV具有中和活性。中和曲线分析发现，部分mAbs表现出完全中和，而另一些则表现为不完全中和，即使在最高浓度下仍有超过10%的相对感染性。在交叉反应性方面，七株SNV反应性mAbs能结合全部四种OWHs，其中SNV-24和SNV-68对DOBV的50%抑制浓度低于1 μg/ml，SNV-53对四种OWHs均有低于1 μg/ml的中和活性。ANDV-44对HTNV具有极强中和活性，50%抑制浓度低于29 ng/ml。受体阻断试验中，三株SNV反应性mAbs和四株ANDV反应性mAbs显示出受体阻断活性。融合抑制试验中，所有在假病毒中和试验中有活性的SNV反应性mAbs以及所有第1组和第2组ANDV反应性mAbs均能抑制细胞-细胞融合。竞争结合分析显示，超过半数的SNV反应性mAbs集中于抗原位点A1，主要识别Gc；超强中和的ANDV反应性mAbs分别位于位点C1、D和F，其中位点F的mAbs识别Gn。SNV-53和ANDV-44均位于位点C1，且均不结合单独的Gn或Gc，提示其可能识别仅在四级结构中存在的表位。动物实验中，对照组所有地鼠在感染后第11天前死亡或濒死安乐死；rsnv-53治疗组仅一只动物死亡，其余存活；randv-44治疗组全部存活，肺部组织病理学明显改善。存活动物肺和肝中均未检测到病毒，而死亡动物多数可检测到病毒。

该研究首次系统描述了从SNV和ANDV感染康复者体内分离的人源单克隆抗体的中和活性和交叉反应性，揭示了NWH感染可诱导针对糖蛋白刺突上多个不同抗原位点的抗体应答。研究发现SNV感染诱导的抗体大多具有广泛交叉反应性而中和效力较弱，ANDV感染诱导的抗体则多为型特异性且中和效力强。SNV-53和ANDV-44识别共同的保守四级结构表位，可能为广谱汉坦病毒疫苗设计提供重要线索。更重要的是，四株mAbs在5 mg/kg低剂量下即可在致死性ANDV地鼠模型中提供显著的暴露后保护，支持其人源化治疗应用的潜力。该研究的假病毒中和筛选与真实病毒PRNT相结合的策略，以及竞争结合分析用于抗原位点定位的方法，为后续汉坦病毒抗体研究提供了可借鉴的技术路径。研究还提示，针对Gc融合蛋白的广谱反应性抗体与针对Gn的强效型特异性抗体分别在不同个体中占主导，反映了宿主免疫应答的多样性，也为理解汉坦病毒表面糖蛋白的免疫原性结构提供了新的视角。尽管存在样本量有限、供者个体差异等局限，该研究为汉坦病毒治疗性抗体开发和泛汉坦病毒疫苗设计奠定了重要基础。