本研究由 Jia 等人于2019年发表在期刊 Cell Death and Disease 上，题为 “Tetrandrine enhances the ubiquitination and degradation of Syk through an AHR-C-Src-C-Cbl pathway and consequently inhibits osteoclastogenesis and bone destruction in arthritis”。主要作者包括 Yugai Jia, Yu Tao, Changjun Lv, Yufeng Xia, Zhifeng Wei 和 Yue Dai，他们的所属机构分别为中国药科大学中药药理系和河北中医学院药理系。
研究的学术背景与目标： 本研究属于骨生物学、免疫学和药理学交叉领域，具体关注关节炎等疾病中骨破坏的分子机制及潜在治疗策略。骨稳态的维持依赖于破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的骨形成之间的平衡。在类风湿性关节炎和骨质疏松等疾病中，破骨细胞的异常活化和过度分化导致骨吸收增强，引发骨侵蚀和骨丢失。因此，靶向破骨细胞的分化和功能成为治疗这些骨丢失性疾病的重要策略。
破骨细胞是由单核/巨噬细胞谱系的造血细胞分化而来的多核巨细胞。其分化的关键触发因素是核因子κB受体活化因子配体，它通过与其受体 RANK 结合，激活下游一系列信号通路，包括脾酪氨酸激酶和磷脂酶Cγ2通路，进而导致钙信号激活和活化T细胞核因子c1的核转位。NFATc1是调控破骨细胞分化相关标志基因表达的关键转录因子。
芳香烃受体是一种配体激活的转录因子，不仅参与外源性物质代谢，近年来越来越多的证据表明其在调节骨代谢，特别是破骨细胞生成中扮演重要角色。然而，许多经典的AHR配体具有显著毒性，限制了其作为治疗药物的应用。因此，寻找和开发安全有效的AHR配体作为治疗破骨生成相关疾病的药物具有重要价值。
粉防己碱是一种双苄基异喹啉生物碱，在中国的临床和动物试验中长期用于治疗风湿痛和关节痛，具有相对较好的安全性。作者团队先前的研究发现，粉防己碱能够通过增强Syk的泛素化和降解来抑制RANKL诱导的破骨细胞生成，并减轻胶原诱导性关节炎大鼠的骨破坏。同时，有研究发现粉防己碱是AHR的潜在配体。
基于以上背景，本研究旨在深入探究：1) AHR是否介导了粉防己碱的抗破骨细胞生成作用；2) 如果是，其具体的分子机制是什么；3) 该作用是否在动物关节炎模型中有效。研究目标明确指向阐明粉防己碱通过AHR信号通路抑制骨破坏的详尽分子机制，为其临床应用提供坚实的理论依据。
详细的研究流程： 本研究设计严谨，流程清晰，主要分为体外细胞实验和体内动物实验两大部分，并运用了多种分子生物学技术进行机制验证。
第一部分：体外细胞实验 1. 细胞模型建立与处理： 研究使用了两种前体破骨细胞模型：小鼠巨噬细胞系 RAW264.7 细胞和小鼠骨髓来源的巨噬细胞。细胞在含有巨噬细胞集落刺激因子和RANKL的成骨分化条件下培养，以诱导其向成熟的破骨细胞分化。实验组分别给予粉防己碱和已知的AHR激动剂3,3’-二吲哚甲烷处理。为了验证AHR的介导作用，设置了AHR拮抗剂CH223191处理组以及使用小干扰RNA敲低AHR表达的组别。 2. 破骨细胞分化评估： 培养5天后，使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒对细胞进行染色。Trap阳性且细胞核数量≥3的多核细胞被认定为成熟的破骨细胞，并在倒置显微镜下进行计数。同时，通过定量PCR技术检测破骨细胞标志基因的mRNA表达水平。 3. AHR激活验证： 为了确认粉防己碱和DIM能够激活前体破骨细胞中的AHR，研究人员通过Western blot检测AHR的核转位，并通过免疫荧光观察其在细胞内的定位。此外，还检测了AHR经典下游靶基因Cyp1a1在蛋白和mRNA水平的表达变化，并使用AHR拮抗剂和siRNA验证了该效应的AHR依赖性。 4. Syk泛素化与降解机制探究： 这是本研究的核心机制部分。研究人员首先通过免疫共沉淀结合Western blot，检测了在RANKL刺激下，粉防己碱和DIM对Syk蛋白泛素化水平的影响。随后，使用蛋白合成抑制剂环己酰亚胺处理细胞，通过Western blot追踪Syk蛋白的降解速率。为了明确AHR在此过程中的作用，同样使用了CH223191和AHR siRNA进行干预。 5. 作用途径鉴别： 为了区分粉防己碱是通过AHR的经典基因组途径还是非基因组途径发挥作用，研究人员使用了针对AHR核转位伴侣蛋白的小干扰RNA。通过比较siArnt对Cyp1a1表达和Syk降解的不同影响，来判断粉防己碱的作用途径。 6. 下游信号通路解析： 研究进一步探究了AHR下游的具体效应分子。通过Western blot检测了E3泛素连接酶C-Cbl及其磷酸化水平，并使用C-Cbl siRNA验证其在Syk泛素化中的必要性。接着，研究了非受体酪氨酸激酶C-Src的磷酸化状态，并使用C-Src特异性抑制剂PP2以及C-Cbl siRNA，厘清了AHR、C-Src、C-Cbl和Syk之间的上下游关系。此外，还通过免疫共沉淀实验分析了这些蛋白之间的相互作用。 7. 下游信号传导抑制验证： 最后，研究人员检测了粉防己碱对Syk-PLCγ2信号通路活性的影响，通过Western blot检测磷酸化Syk和磷酸化PLCγ2的水平。同时，通过免疫荧光和Western blot观察了NFATc1的核转位情况，并使用AHR拮抗剂验证了该抑制作用的AHR依赖性。
第二部分：体内动物实验 1. 动物模型建立： 使用雌性Wistar大鼠，通过在其尾部皮内注射鸡Ⅱ型胶原与弗氏完全佐剂的乳化液，诱导胶原诱导性关节炎模型。在出现明显的关节炎临床症状后开始给药治疗。 2. 给药方案： 将粉防己碱、DIM和AHR拮抗剂CH223191悬浮于0.5%羧甲基纤维素钠溶液中，对大鼠进行连续14天的口服灌胃。设置正常对照组、模型对照组、粉防己碱单药治疗组、DIM单药治疗组、粉防己碱与CH223191联合治疗组以及DIM与CH223191联合治疗组。 3. 骨破坏与破骨细胞活性评估： 实验结束后，取大鼠胫骨进行以下分析：a) 对胫骨近端骨骺（排除皮质骨）的石蜡切片进行TRAP染色，计数破骨细胞数量；b) 通过免疫组织化学染色，检测组织中Cyp1a1阳性细胞和磷酸化Syk阳性细胞的数量；c) 使用酶联免疫吸附测定法检测血清中TRAP5b的活性，该酶是破骨细胞活性的循环标志物。 4. 骨微结构分析： 使用微型计算机断层扫描仪对大鼠的踝关节和膝关节进行扫描，获得三维和二维重建图像。利用配套的CT分析软件，定量分析胫骨近端骨骺区域的骨矿物质密度、骨体积分数、骨小梁厚度和骨小梁分离度等骨微结构参数。
数据分析流程： 所有数据均以均值±标准误表示。使用单因素方差分析进行组间比较，若存在显著性差异，则进一步采用Tukey多重比较检验。每个实验至少独立重复三次。*p < 0.05 或 **p < 0.01 被认为具有统计学显著性。
主要研究结果： 体外结果： 1. 粉防己碱以AHR依赖性方式抑制破骨细胞生成： 0.3 μM的粉防己碱和10 μM的DIM能显著抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞和BMMs向破骨细胞分化，并降低破骨细胞标志基因的表达。AHR拮抗剂CH223191或AHR siRNA几乎完全逆转了粉防己碱和DIM的这种抑制作用，证明其抗破骨生成作用是AHR依赖性的。 2. 粉防己碱激活前体破骨细胞中的AHR： Western blot和免疫荧光结果显示，粉防己碱和DIM处理促进了AHR的核转位。同时，它们显著上调了Cyp1a1的蛋白和mRNA表达，而CH223191或AHR siRNA能阻断这一诱导作用，证实粉防己碱确实是前体破骨细胞中AHR的有效激活剂。 3. 粉防己碱通过AHR非基因组途径增强Syk的泛素化与降解： 粉防己碱和DIM显著增强了RANKL诱导的Syk泛素化，并加速了其蛋白降解。CH223191或AHR siRNA能大幅削弱此效应。当使用siRNA敲低Arnt蛋白后，粉防己碱和DIM对Cyp1a1表达的诱导作用被完全阻断，但对Syk降解的促进作用却不受影响。这清晰地证明，粉防己碱是通过AHR的非基因组途径来促进Syk降解的，该途径不依赖于Arnt介导的转录激活。 4. AHR-C-Src-C-Cbl通路是核心机制： 机制深入研究发现：a) 粉防己碱和DIM能快速诱导C-Cbl的磷酸化（激活），且该效应可被CH223191或AHR siRNA阻断。敲低C-Cbl则完全取消了粉防己碱和DIM对Syk泛素化和降解的增强作用。b) 粉防己碱和DIM同样能快速诱导C-Src的磷酸化，且该效应也是AHR依赖性的。C-Src抑制剂PP2能几乎完全消除粉防己碱和DIM对C-Cbl磷酸化的促进作用。c) C-Cbl的敲低不影响粉防己碱和DIM对C-Src的激活，表明C-Cbl位于C-Src的下游。d) 免疫共沉淀实验进一步揭示，粉防己碱处理促进了AHR与C-Src的解离，同时增强了AHR与C-Cbl以及AHR与Syk的结合。 5. 下游信号通路被抑制： 由于Syk被泛素化降解，其活性形式减少。Western blot结果显示，粉防己碱和DIM处理显著降低了RANKL诱导的Syk和PLCγ2的磷酸化水平。更重要的是，它们还抑制了NFATc1的核转位。所有这些抑制作用均可被AHR拮抗剂CH223191所逆转，从而将上游的AHR激活与下游的破骨细胞分化关键信号事件直接联系起来。
体内结果： 在CIA大鼠模型中，口服粉防己碱或DIM产生了显著的疗效：1) 增加了胫骨中Cyp1a1阳性细胞的数量，表明AHR在体内被激活；2) 减少了胫骨中磷酸化Syk阳性细胞和TRAP阳性破骨细胞的数量；3) 降低了血清中TRAP5b的活性；4) 改善了骨微结构，表现为骨矿物质密度、骨体积分数和骨小梁厚度的增加，以及骨小梁分离度的减小。微型CT图像直观显示，治疗组大鼠的踝关节和膝关节骨侵蚀明显减轻。最关键的是，当粉防己碱或DIM与AHR拮抗剂CH223191联合使用时，上述所有有益效应几乎被完全抵消。这强有力的体内证据证实，粉防己碱在关节炎模型中抑制破骨细胞生成和保护骨结构的功效，确实是通过激活AHR通路实现的。
结论与意义： 本研究得出了明确而重要的结论：粉防己碱通过激活芳香烃受体，经由AHR-C-Src-C-Cbl信号通路，增强脾酪氨酸激酶的泛素化修饰和蛋白酶体降解，进而抑制Syk-PLCγ2-NFATc1信号轴的活化，最终阻遏破骨细胞的分化，并在关节炎动物模型中有效减轻骨破坏。
其科学价值在于：1) 阐明了新机制： 首次系统揭示了粉防己碱这一传统中药活性成分通过AHR非基因组信号通路抑制破骨细胞生成的完整分子机制，即“AHR激活 → C-Src释放与激活 → C-Cbl磷酸化 → Syk泛素化降解 → 破骨分化信号中断”。这为理解AHR配体调控骨代谢提供了新的视角和范例。2) 确认了新靶点： 明确将AHR确立为粉防己碱抗骨破坏作用的直接分子靶点，为其治疗作用的物质基础提供了分子层面的解释。3) 连接了传统与现代： 将传统中药的临床疗效与现代分子药理学机制紧密结合，为中药现代化研究提供了范本。
其应用价值在于：1) 药物研发前景： 粉防己碱作为一种相对安全、已长期临床应用的化合物，本研究为其“老药新用”——治疗类风湿性关节炎、骨质疏松等以骨破坏为特征的疾病——提供了强有力的临床前证据和详尽的机制支持，有望加速其相关新适应症的开发。2) 靶点启示： 研究提示AHR，特别是其非基因组信号通路，可能成为开发新型抗骨吸收药物的一个有潜力的靶点。相比许多高毒性经典AHR配体，粉防己碱展示了更好的安全性特征。3) 治疗策略优化： 粉防己碱在先前研究中显示能调节免疫失衡（恢复Th17/Treg平衡）以减轻滑膜炎，在本研究中又证实能直接抑制破骨细胞介导的骨侵蚀。这种对滑膜炎和骨破坏的“双重抑制”作用，可能使其比目前常用的改善病情抗风湿药或单纯的抗骨吸收药物更具优势。
研究亮点： 1. 机制阐释的系统性与深度： 研究从整体表型到具体分子，从体外细胞到体内动物，从上游受体到下游转录因子，层层递进，逻辑严密，完整勾勒出了粉防己碱的作用通路图谱。 2. 非基因组途径的发现： 明确区分并证实了粉防己碱通过AHR的非基因组途径（独立于Arnt）发挥促Syk降解作用，而通过基因组途径诱导Cyp1a1表达。这一发现丰富了AHR信号转导模式的认识。 3. 分子关联的精细解析： 通过抑制剂、基因敲低、免疫共沉淀等多种手段，清晰阐明了AHR、C-Src、C-Cbl和Syk四个关键蛋白之间的动态相互作用和上下游关系，揭示了信号传递的精确步骤。 4. 体内外证据的充分耦合： 体外机制研究的每一个关键环节（AHR依赖性、Syk降解、信号抑制）都在CIA大鼠模型中通过药理学干预（使用AHR拮抗剂）得到了验证，使得结论非常可靠。 5. 研究的转化医学意义： 直接对接临床需求，聚焦于具有明确临床疗效且安全性较好的天然产物，致力于阐明其科学内涵，具有明确的转化应用导向。
本研究是一项设计周密、数据扎实、结论清晰的优秀学术工作，不仅深刻揭示了粉防己碱抗关节炎骨破坏的分子奥秘，也为靶向AHR通路治疗骨代谢疾病提供了新的思路和候选药物。