本研究由南京中医药大学药学院的张志同、戚亚丽等学者完成，通讯作者为严国军教授，合作单位包括贵州中医药大学药学院和南京中医药大学附属江苏省中医院放疗科。该研究成果发表于国际知名期刊《Phytomedicine》第135卷（2024年），文章编号156104，于2024年9月29日在线发表。研究得到了国家重点实验室创新项目、国家自然科学基金及国家重点研发计划等项目的资助。
糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病（diabetes mellitus, DM）最严重的微血管并发症之一，也是终末期肾病及糖尿病患者死亡的主要原因。DN的主要病理特征包括肾小球基底膜增厚、系膜基质扩张及肌酐清除率改变。尽管DN的病因尚未完全阐明，但大量临床与实验研究表明，晚期糖基化终末产物（advanced glycation end-products, AGEs）在疾病的发生发展过程中发挥着关键作用。在持续高血糖状态下，非酶糖基化反应、葡萄糖自氧化、脂质过氧化及果糖代谢异常活跃，产生大量对肾脏有害的活性羰基化合物（reactive carbonyl compounds, RCS），如乙二醛（glyoxal, GO）、甲基乙二醛（methylglyoxal, MGO）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）及4-氧代-2-壬烯醛等，进一步促进AGEs的生成。AGEs与特异性受体RAGE结合后，不仅扰乱肾脏中活性氧（reactive oxygen species, ROS）的平衡，还抑制蛋白激酶B（AKT）磷酸化，降低下游核因子E2相关因子2（Nrf2）的表达，从而削弱肾脏的抗氧化能力，形成恶性循环。
当归补血汤（Dang-Gui-Bu-Xue Decoction, DBD）出自金代李东垣《内外伤辨惑论》，由黄芪（Astragalus membranaceus）与当归（Angelica sinensis）按5:1比例组成，传统上用于治疗“消渴”（即中医对糖尿病的称谓）。临床与实验研究均显示DBD对DN具有治疗作用，并具有良好的体内抗氧化活性。然而，DBD干预DN的具体机制及其主要活性成分尚不完全清楚。因此，本研究旨在系统阐明DBD改善DN的疗效及其可能的肾保护机制，并在体外筛选其主要活性成分。
本研究采用了系统的实验设计，共包含多个相互关联的研究环节，具体如下：
1. 动物模型建立与给药方案。 研究选用50只雄性C57BL/6小鼠（SPF级，17±2 g，5周龄），适应性饲养一周后，随机选取10只作为对照组给予标准饲料，其余40只给予60%高脂饲料（high-fat diet, HFD）喂养8周，并连续5天腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin, STZ，40 mg/kg）以诱导糖尿病模型。空腹血糖（fasting blood glucose, FBG）超过11.1 mM的小鼠被视为糖尿病小鼠，随后随机分为模型组（MOD）、DBD低剂量组（6.44 g/kg/天）、DBD高剂量组（12.88 g/kg/天）和二甲双胍组（300 mg/kg/天），每组10只。给药期间除对照组外均维持高脂饲料喂养。实验过程中监测能量摄入、饮水量、体重、血糖和血脂等指标。
2. 生化指标与病理组织学检测。 通过自动生化分析仪测定血浆中FBG、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、胱抑素C（Cys-C）、血肌酐（Cr）及血尿素氮（BUN）水平。同时检测血浆糖化血清蛋白（GSP）及肾脏中AGEs、超氧化物歧化酶（SOD）、MDA和谷胱甘肽（GSH）含量。肾组织经4%多聚甲醛固定后，进行苏木精-伊红染色（HE）、Masson染色和过碘酸雪夫染色（PAS）以评估肾脏病理状态，包括肾小球肥大、间质炎性细胞浸润、纤维化及糖原沉积。此外，通过免疫组织化学检测nephrin和TGF-β1的表达以评估肾小球滤过能力和纤维化程度，并通过免疫荧光检测RAGE蛋白的表达与定位。
3. DBD化学成分及入血成分分析。 采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技术对DBD的化学成分进行全面分析，在正负离子模式下共鉴定出129种代表性成分，包括39种黄酮类、25种有机酸、21种苯酞类、19种三萜类、11种α-氨基酸及14种其他成分。进一步对DBD灌胃后的血浆进行入血成分分析，在生理状态下鉴定出23种入血成分，在病理状态下鉴定出28种入血成分，其中22种为共有成分。病理状态下入血成分包括9种黄酮类、8种苯酞类、6种有机酸、3种三萜类及2种其他成分。所有入血成分均通过了Lipinski五规则评估，且无明显肝毒性。
4. 网络药理学分析。 利用入血成分的作用靶点与DN疾病靶点进行交集分析，获得91个潜在治疗靶点。通过网络拓扑分析筛选出22个节点度值大于5的潜在活性成分。蛋白-蛋白互作（PPI）网络分析显示AKT1、ALB和TNF为关键靶点。KEGG通路富集分析获得120条通路，其中AGEs/RAGE通路及其下游PI3K/AKT通路与DN密切相关，提示DBD可能通过调节AGEs/RAGE/AKT信号通路发挥抗DN作用。
5. 体外抗糖基化实验。 采用牛血清白蛋白（BSA）-葡萄糖、BSA-果糖和BSA-MGO三个非酶糖基化模型评估DBD的抗糖基化能力。通过硝基四氮唑蓝（NBT）法检测果糖胺（fructosamine）含量，利用Girard’s试剂T法检测α-二羰基化合物水平，通过多功能酶标仪检测AGEs及蛋白质糖氧化产物（二酪氨酸、犬尿氨酸、N′-甲酰犬尿氨酸）的生成情况。
6. Western blotting分析。 取肾组织提取总蛋白，经SDS-PAGE电泳分离后转膜，孵育抗RAGE、GAPDH、AKT、p-AKT、Nrf2、Keap1、HO-1、GLO-1及NQO1等一抗及相应二抗，通过ImageJ软件进行图像分析，以GAPDH为内参标准化各蛋白表达水平。
7. 羰基化合物代谢谱分析。 采用课题组前期建立的化学衍生化方法结合UPLC-MS/MS分析肾脏组织中羰基化合物。衍生化试剂为Girard’s试剂P（GP），通过MarkerView软件进行峰检测、对齐和归一化，利用SIMCA 14.1进行多变量统计分析，包括主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。差异代谢物的筛选标准为变量投影重要性（VIP）值>1.0且P<0.05，通过HMDB数据库对化合物进行鉴定。
8. 活性成分体外筛选。 结合入血成分分析和网络拓扑分析结果，选取12种主要入血成分进行抗糖基化活性测定和MTT细胞活力实验。抗糖基化实验设置五种浓度梯度（25、50、100、200、400 μM），以氨基胍（aminoguanidine, AG）为阳性对照。MTT实验采用人肾小管上皮细胞（HK-2），以700 μM MGO诱导细胞损伤模型，检测各成分对细胞活力的保护作用。
1. DBD改善DN小鼠的代谢紊乱和肾功能损伤。 与对照组相比，模型组小鼠的能量摄入和饮水量显著增加，FBG和GSP水平显著升高，血脂指标（TG、TC、HDL-C、LDL-C）明显异常，表明存在严重的糖脂代谢紊乱。DBD干预后，上述指标均得到显著改善并向正常水平回归。肾功能方面，模型组小鼠肾脏指数（KI）、Cr、尿素和Cys-C水平显著升高，而DBD治疗组这些指标均被有效抑制，说明DBD具有明确的肾保护作用。
2. DBD减轻肾脏病理损伤。 组织病理学检查显示，模型组小鼠肾组织出现典型的DN病理改变，包括肾小球肥大、间质炎性细胞浸润、系膜区扩张、肾间质纤维化及糖原沉积。DBD干预组肾脏组织形态明显改善，纤维化和糖原沉积减少。免疫组化结果显示，模型组nephrin表达显著下降而TGF-β1表达显著升高，DBD治疗有效逆转了这些异常，表明DBD能够提高肾小球滤过率并抑制肾纤维化。
3. DBD的化学组成及入血成分特征。 UPLC-Q-TOF-MS/MS分析鉴定出DBD中129种化学成分，以黄酮类和有机酸类为主。病理状态下入血成分多于生理状态（28种 vs 23种），且共有成分在两种状态下的血浆浓度存在差异，提示疾病状态可能影响药物的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）过程。
4. 网络药理学预测DBD的作用通路。 91个潜在治疗靶点的KEGG富集分析显示，AGEs/RAGE通路及其下游PI3K/AKT通路可能与DBD干预DN密切相关。在排名前20的富集通路中，AGEs/RAGE信号通路位居前列，提示该通路可能是DBD发挥肾保护作用的关键环节。
5. DBD抑制非酶糖基化产物生成及RAGE表达。 体外抗糖基化实验表明，不同浓度的DBD在BSA-葡萄糖和BSA-果糖模型中均能抑制果糖胺的生成，在BSA-果糖模型中抑制α-二羰基化合物的生成，并在BSA-果糖和BSA-MGO模型中抑制AGEs及蛋白质氧化产物的形成。体内实验进一步证实，DN小鼠肾脏中AGEs水平显著升高，而DBD给药能有效降低AGEs水平。免疫荧光和Western blot结果显示，DN小鼠肾组织中RAGE蛋白表达显著上调，DBD干预能够有效降低RAGE的表达，从而阻断AGEs/RAGE信号级联反应。
6. DBD调节AGEs/RAGE下游信号通路减轻氧化应激。 模型组小鼠肾脏中MDA和ROS含量显著升高，SOD和GSH活性明显降低，提示存在严重的氧化应激。DBD治疗后这些异常均得到缓解。免疫组化和Western blot分析显示，DN小鼠肾组织中p-AKT、p-AKT/AKT比值、Nrf2、Nrf2/Keap1比值、NQO1、HO-1及GLO1的蛋白表达均显著降低，而DBD干预后上述蛋白水平显著回升（除GLO1外均有统计学差异），表明DBD能够通过抑制AGEs/RAGE通路的激活，减少ROS积累，并调控下游AKT/Nrf2信号通路以增强肾脏抗氧化能力。
7. DBD调控羰基化合物代谢谱。 代谢组学分析显示，对照组与模型组的代谢数据在主成分分析和PLS-DA模型下完全分离，DBD治疗组（尤其是高剂量组）的代谢谱向对照组靠近，表明DBD能够改善DN小鼠异常的羰基代谢谱。通过OPLS-DA模型及HMDB数据库鉴定，共发现21种内源性羰基化合物在对照组与模型组之间存在显著差异，其中16种在DBD干预后得到显著调节。这些化合物包括GO、MGO、4-氧代-2-己烯醛（4-oxo-2-hexenal）、4-羟基己烯醛（4-hydroxyhexenal）、4-羟基壬烯醛（4-hydroxy-2-nonenal）等活性羰基化合物，以及多种神经酰胺、二酰甘油和溶血磷脂类化合物。
8. 主要活性成分的筛选。 抗糖基化实验和MTT实验的综合结果表明，7种成分——毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（calycosin-7-O-β-D-glucoside）、毛蕊异黄酮（calycosin）、芒柄花素（formononetin）、绿原酸（chlorogenic acid）、阿魏酸（ferulic acid）、咖啡酸（caffeic acid）和Z-藁本内酯（Z-ligustilide）——可能是DBD调节羰基化合物代谢谱和AGEs/RAGE通路改善DN的主要活性成分。其中，4种黄酮类成分表现出良好的抗糖基化活性和对MGO损伤的细胞保护作用，3种酚酸类成分显著抑制AGEs生成，Z-藁本内酯在BSA-果糖模型及MGO诱导的细胞模型中展现了优异的活性。
本研究首次系统阐明了DBD通过调节羰基化合物代谢谱和AGEs/RAGE信号通路改善DN的作用机制。DBD能够抑制非酶糖基化反应，减少活性羰基化合物和AGEs的生成，降低RAGE蛋白表达，阻断AGEs/RAGE信号级联反应，进而减少ROS积累，激活下游AKT/Nrf2通路，上调HO-1和NQO1等抗氧化蛋白的表达，最终减轻肾脏氧化应激损伤。此外，研究筛选出7种主要活性成分，为DBD的物质基础研究提供了重要依据。
本研究的科学价值在于：（1）首次将羰基化合物代谢谱分析与AGEs/RAGE通路研究相结合，全面揭示了DBD抗DN的作用机制；（2）通过病理状态下入血成分分析结合网络药理学预测，提高了机制研究的临床相关性；（3）通过体外抗糖基化实验和细胞实验筛选出主要活性成分，为DBD的质量控制和药物开发提供了参考。
本研究的主要亮点包括：（1）首次证明DBD能够调节肾脏羰基化合物代谢谱，涉及GO、MGO、4-HNE等多种活性羰基化合物以及神经酰胺、二酰甘油等脂质羰基化合物；（2）在病理状态下进行入血成分分析，更贴近临床实际，发现了28种入血成分；（3）采用化学衍生化结合UPLC-MS/MS技术检测低丰度、难离子化的羰基化合物，克服了传统分析方法的局限；（4）综合运用体内药效学、网络药理学、代谢组学及体外实验筛选等多种技术手段，形成了从整体到分子、从体内到体外的完整研究链条。