关于一种来自菜豆的新型环氧化物水解酶PvEH2的极高对映选择性与区域选择性研究
一、 研究团队与发表信息
本研究由来自中国江南大学多个学院的科研人员合作完成。第一作者为李闯和胡蝶，通讯作者为吴敏琛（江南大学无锡医学院）和李剑芳（江南大学食品科学与技术学院）。该研究成果以题为“Asymmetric hydrolysis of styrene oxide by PvEH2, a novel Phaseolus vulgaris epoxide hydrolase with extremely high enantioselectivity and regioselectivity”的短篇通讯形式，发表于爱思唯尔（Elsevier）旗下的学术期刊《Catalysis Communications》第102卷（2017年），文章于2017年8月24日在线发布。
二、 学术背景与研究目的
本研究隶属于生物催化与酶工程领域，具体聚焦于环氧化物水解酶（Epoxide Hydrolases, EHs）的发现、表征与应用。手性环氧化物及其对应的邻二醇是合成精细化学品、药物和农用化学品的重要手性砌块。其中，苯乙烯环氧化物（Styrene Oxide, SO）及其水解产物®-或(S)-苯基乙二醇（Phenyl-1,2-ethanediol, PED）是合成抗癌剂、肾上腺素受体激动剂和激酶抑制剂的关键中间体。尽管化学法（如Jacobsen环氧化和Sharpless双羟化）可用于合成这些手性分子，但通常需要使用可能造成污染的催化剂，且在某些情况下产物的对映体过量值（Enantiomeric Excess, ee）和/或产率不尽如人意。
环氧化物水解酶能够立体选择性地催化水分子加成到环氧环上，是一种环境友好的生物转化途径。然而，已发现的来自植物、微生物、哺乳动物和无脊椎动物的EH中，极少能同时展现出理想的对映选择性和区域选择性。例如，来自*Aspergillus usamii*的AuEH2在拆分外消旋苯乙烯氧化物（rac-SO）时，仅能以38%的产率获得对映体过量值为99.2%的(S)-SO，低于50%的理论最大产率。而来自马铃薯的StEH虽然对映选择性比值（Enantiomeric Ratio, *E*值）较高（E=30），但在延长反应时间后，其产物®-PED的对映体纯度会下降。
因此，本研究旨在从菜豆（*Phaseolus vulgaris*）中发掘具有优异立体选择性的新型环氧化物水解酶，并评估其在不对称水解反应中同时制备高光学纯度®-苯乙烯氧化物和®-苯基乙二醇的潜力，以期为绿色手性合成提供高效的生物催化剂。
三、 详细研究流程
本研究遵循了从生物信息学预测、基因克隆表达、酶学性质表征到应用验证的系统性流程。
1. 酶基因的计算机辅助筛选与序列分析： 研究人员首先以本实验室先前报道的菜豆EH1（PvEH1，GenBank登录号AKJ75509）为模板，在NCBI数据库中进行同源序列搜索和多重序列比对。他们设定筛选标准为与PvEH1序列相似性高于75%。从检索到的六个功能未知的假设蛋白中，选择了一个同样来源于菜豆、与PvEH1相似性达80.1%的假设蛋白序列（XP_007147001），将其命名为PvEH2。通过ClustalW2程序将PvEH2与其他五种植物EH进行多重序列比对，确认PvEH2具有α/β折叠水解酶超家族的典型保守基序：HGXP、GXSMXS/T和SMXNUXSMSM（其中X、SM、NU分别代表任意、小分子和亲核氨基酸残基）。基于比对结果，预测了PvEH2的催化三联体由Asp101、His295和Asp260组成，并识别出可能在底物结合和环氧环开环中起关键作用的保守酪氨酸残基（Tyr150和Tyr230）。这些分析为PvEH2可能具有EH活性提供了理论依据，从而将其确定为研究对象。
2. PvEH2基因的克隆与在大肠杆菌中的表达： 从市售菜豆中提取总RNA，使用Oligo dT-Adaptor引物通过逆转录获得第一链cDNA。设计一对带有Nde I和Xho I酶切位点的引物（PV2-F和PV2-R，见表S1），通过PCR扩增出约1.0 kb的*pveh2*基因。将扩增产物连接至表达载体pET-28a(+)，经测序验证后，得到重组表达质粒pET-28a-pveh2。将该质粒转化至表达宿主E. coli Rosetta(DE3)中，构建重组菌株E. coli/pveh2。同时，将空载体pET-28a(+)转化的菌株作为阴性对照（E. coli/pET-28a）。 将重组菌株接种于含卡那霉素的LB培养基中，在37°C培养至OD600达到0.6-0.8后，加入0.2 mM IPTG，于20°C诱导表达9小时。收集菌体，重悬于磷酸盐缓冲液（50 mM， pH 7.2）中，制成湿细胞浓度为100 mg/mL的细胞悬液，作为后续生物催化的催化剂。SDS-PAGE分析显示，重组PvEH2（rePvEH2）的表观分子量约为38.1 kDa，与其理论分子量（37,898 Da）相符。酶活测定表明，表达rePvEH2的全细胞催化剂活性为8.0 U/g湿细胞，而阴性对照无活性。研究还发现，诱导温度超过25°C会导致rePvEH2大部分形成不溶性包涵体，酶活极低。
3. rePvEH2的立体选择性分析： 本研究系统地评估了rePvEH2的底物谱和立体选择性。 * 底物谱与对映选择性测定： 选取了十种外消旋环氧化物（包括苯乙烯氧化物及其多种衍生物，如对位、间位取代的硝基、氯代、甲基苯乙烯氧化物以及苄基和苯基缩水甘油醚等，见图1）作为底物。将1.0 mL重组全细胞悬液分别与1.0 mL各底物（10 mM）在磷酸盐缓冲液中混合，于25°C进行水解反应。在不同时间点取样，用乙酸乙酯萃取，使用手性气相色谱（GC）或高效液相色谱（HPLC）分析剩余底物的对映体组成和转化率（*C*）。根据公式计算对映选择性比值（*E*值），*E*值越高，表明酶对一种对映体的偏好性越强。结果显示，rePvEH2对大多数底物优先水解(S)-对映体。其对rac-苯乙烯氧化物（rac-1a）的*E*值大于200，表现出极高的对映选择性。相比之下，对rac-3a和rac-5a的*E*值较低（分别为1.6和1.9），而对rac-2a和rac-4a未检测到活性。 * 区域选择性测定： 区域选择性系数（α_S 和 β_R）反映了酶攻击(S)-环氧化物中空间位阻较大的苄位碳（C_α）和攻击®-环氧化物中空间位阻较小的末端碳（C_β）的倾向性。本研究通过两种方式测定：对于(S)-和®-苯乙烯氧化物（1a），直接使用单一对映体作为底物，根据生成的二醇产物的构型计算α_S和β_R；对于其他底物（2a-10a），则使用其外消旋体，通过测得的产物对映体过量值（*ee_p*）、底物对映体过量值（*ee_s*）和转化率（*C*），根据特定公式推导得出。结果显示，rePvEH2对(S)-1a、3a和5a主要攻击C_α（α_S > 90%），生成构型翻转的®-二醇；同时对®-3a和5a主要攻击C_β（β_R > 95%），生成构型保持的®-二醇。这种对同一底物两种对映体的高且互补的区域选择性，意味着rePvEH2有潜力催化这些底物的“对映汇聚式”水解，即从外消旋底物理论上可获得100%产率的单一构型产物。对于底物7a和10a，rePvEH2显示出较高的*E*值（分别为18.9和23.0），但区域互补性较差，因此适用于动力学拆分。
4. 利用全细胞催化剂不对称水解外消旋苯乙烯氧化物： 为了验证rePvEH2的实际应用潜力，研究进行了放大规模的生物转化实验。在25°C条件下，使用E. coli/pveh2全细胞（终浓度50 mg/mL）催化水解20 mM的外消旋苯乙烯氧化物（rac-1a），反应总体积为10 mL。在60分钟内定时取样监测反应进程。通过手性色谱分析反应液中剩余底物和生成产物的浓度与对映体组成，计算®-1a的剩余产率（*Y_S*）和对映体过量值（*ee_s*），以及®-1b的产率（*Y_P*）和对映体过量值（*ee_p*）。
四、 主要研究结果
1. 基因筛选与序列分析结果： 成功从菜豆中鉴定出一个新的EH编码基因*pveh2*，其编码的蛋白PvEH2具有典型的α/β折叠水解酶家族保守结构域和预测的催化三联体，暗示其具备EH功能。
2. 酶的表达与基本性质结果： *pveh2*基因在大肠杆菌中成功表达，获得可溶性且有活性的重组酶rePvEH2。最佳诱导条件为20°C、0.2 mM IPTG诱导9小时，在此条件下全细胞酶活为8.0 U/g湿细胞。
3. 立体选择性表征结果： * 对映选择性： rePvEH2对苯乙烯氧化物（1a）展现出前所未有的高对映选择性，*E*值 > 200。这是迄今为止报道的所有EH中对rac-1a的最高*E*值，显著高于之前报道的StEH (E=30)、Kau2 (E=65)和CvEH (E=8.8)。这意味着rePvEH2对(S)-1a具有极强的偏好性，在动力学拆分中几乎可以完全保留®-1a。 * 区域选择性： rePvEH2对(S)-1a和®-1a表现出高且互补的区域选择性：攻击(S)-1a的C_α系数（α_S）高达99.1%，攻击®-1a的C_β系数（β_R）为69.8%。这种特性使得在反应中，无论水解哪种对映体，都倾向于生成®-构型的产物苯基乙二醇（1b）。
4. 不对称水解应用结果： 全细胞催化20 mM rac-1a的反应进程曲线清晰展示了rePvEH2的优异性能（图4a）。反应过程中，(S)-1a的浓度迅速下降，而®-1a的浓度几乎保持不变，导致®-1a的*ee_s*值快速升高。同时，由于高互补的区域选择性，®-1b的*ee_p*值在整个反应过程中始终保持在95%以上。在反应进行到40分钟时（转化率C = 51.0%），同时获得了ee_s > 99.5%、产率达49.4%的®-1a，以及*ee_p*为96.2%、产率达49.7%的®-1b。 值得注意的是，®-1a的产率非常接近其理论最大值（50%），这在实际应用中极具价值。研究也发现，当底物浓度升高至50 mM时，反应在6小时内转化率仍低于25%，这可能与酶在操作条件下的稳定性、底物或产物的抑制以及环氧化物在水中的低溶解度有关。文章提及可通过定向进化提高酶稳定性或采用双相反应体系来缓解这些问题。
五、 研究结论与意义
本研究通过计算机辅助分析，从菜豆中成功发现并鉴定了一种新型环氧化物水解酶PvEH2。该酶在重组表达后，展现出对苯乙烯氧化物极高的对映选择性（E > 200）和区域选择性（α_S = 99.1%）。利用表达rePvEH2的全细胞催化剂进行不对称水解，能够同时高效制备高光学纯度的®-苯乙烯氧化物和®-苯基乙二醇，且®-1a的产率接近理论极限。这一成果不仅增加了具有高立体选择性EH的数量，为手性环氧化物和二醇的绿色合成提供了性能优异的候选生物催化剂，而且为深入研究PvEH2的催化机制奠定了坚实基础。该酶在制药和精细化工领域具有潜在的应用价值。
六、 研究亮点
七、 其他有价值内容
本研究得到了中国国家自然科学基金（编号21676117）和江苏省研究生创新训练项目（编号KYLX16_0804）的资助。文中还提及了补充数据（Supplementary data）的在线获取地址。参考文献部分引用了该领域的重要工作，为读者提供了深入了解的背景资料。此外，研究中对高浓度底物转化率低的问题进行了分析，并指出了可能的解决方向（如定向进化、双相体系），体现了研究的深度和前瞻性。