纤维素基抗菌泡沫材料研究：通过冰晶模板法调控阳离子纳米纤维素的抗菌响应

主要作者与研究机构

本研究由来自巴西坎皮纳斯大学（University of Campinas, UNICAMP）化学研究所的Caio G. Otoni、Juliana S.L. Figueiredo及Watson Loh，与巴西国家纳米技术实验室（LNNano）、巴西能源与材料研究中心（CNPEM）的Larissa B. Capeletti、Mateus B. Cardoso和Juliana S. Bernardes共同完成。通讯作者为Watson Loh博士和Caio G. Otoni博士。该研究成果于2019年4月12日被美国化学会（American Chemical Society）旗下期刊《ACS Applied Bio Materials》以“仅接受”（Just Accepted）手稿的形式在线发表。

研究背景与目标

在当今社会对可持续性与多功能性日益增长的需求驱动下，利用可再生资源开发活性材料成为研究热点。纤维素作为一种多糖，因其分子骨架上富含羟基而具备极高的功能化潜力，特别是通过自组装能形成具有低密度、高机械强度的纳米纤维素，如纳米原纤化纤维素（nanofibrillated cellulose, NFC）。NFC不仅保留了纤维素的特性，还兼具纳米材料的高比表面积和柔韧性，为表面改性（如阳离子化以引入抗菌功能）提供了广阔空间。

抗菌材料设计中，季铵盐化合物（quaternary ammonium compounds, QACs）被广泛证实能有效抑制细菌、真菌和病毒的生长。其抗菌机制是通过静电作用与带负电的细菌细胞膜磷脂双分子层相互作用，导致二价阳离子位移，破坏细胞膜的离子完整性。将QACs通过化学键永久接枝在纤维素上，可避免活性化合物浸出到环境中，从而延长材料的使用寿命并降低潜在毒性。其中，吉拉尔特试剂T（Girard’s reagent T, GRT）作为一种含有季铵基团的化合物，可与经高碘酸盐氧化产生的二醛纤维素（dialdehyde cellulose, DAC）发生席夫碱反应，实现纤维素的阳离子化。

然而，关于GRT阳离子化纳米纤维素抗菌作用的研究信息十分有限。此外，NFC水分散液因其纤维的高长径比和高缠结特性，即使在低固含量下也呈现凝胶状行为，这为通过控制分散介质移除来生产轻质泡沫、气凝胶、冷冻凝胶（cryogel）等材料提供了可能。本研究旨在利用GRT阳离子化纳米纤维素，通过不同的冷冻铸造（freeze-casting）或蒸发干燥工艺，开创性地制备具有接触活性抗菌功能的泡沫材料，并系统探究泡沫成型方案对材料形貌及抗菌性能的影响，特别是除孔隙率外，孔径大小是否对细菌灭活效率起关键作用。

研究流程与实验方法

研究的整体流程分为纤维素的表面改性、纳米原纤化解离、泡沫成型制备、以及材料表征与抗菌性能测试四大步骤。

第一步：纤维素纸浆的表面改性。研究以商业漂白桉树牛皮纸浆为原料，首先在避光条件下，用高碘酸钠（sodium periodate）在50°C水溶液中对质量分数2.5%的纤维素纸浆进行氧化反应3小时，以选择性地将失水葡萄糖单元（anhydroglucose unit, AGU）上第2和第3位碳原子的邻位仲羟基氧化成高活性的醛基，制得二醛纤维素。随后，将氧化纸浆再次分散，调节pH至4.5，加入GRT在55°C下反应1小时，通过席夫碱反应将季铵基团接枝到纤维素骨架上。反应完成后，对阳离子化产物进行充分洗涤和透析以去除未反应的化学物质。整个表面改性过程在水性介质中于温和条件下进行，避免了有害化学品的使用。

第二步：阳离子化纤维素纸浆的机械解离。将原始、氧化后及阳离子化后的纤维素纸浆（浓度均为2.5 wt%）先用平底搅拌机进行初步解离，再调整至3 wt%的固含量，通过超微粒研磨机（SuperMasscolloider grinder）以约1500转/分钟的转速，在逐渐缩小的磨盘间隙下循环研磨30次，分别得到对应的纳米原纤化纤维素，记为NFC、ONFC和CNFC。

第三步：泡沫成型工艺。研究采用四种不同的成型方案，以质量分数1.5%的NFC水分散液为原料，装入模具后进行处理。蒸发干燥（Evaporative Drying, ED）将分散液在40°C下干燥成致密薄膜。冷冻干燥则包括三种方案：将分散液在-10°C的聚丙烯模具中缓慢冷冻1天（Slow Freezing for 1 day, SF1）或7天（SF7），以及在-196°C的铜模具中进行快速冷冻（Rapid Freezing, RF）15分钟，随后所有冷冻样品均在约-58°C下进行48小时的冷冻干燥以升华冰晶，形成多孔整块材料。

第四步：材料表征与抗菌性能测试。研究运用了多种技术对材料的物理化学特性和形貌进行表征。Zeta电位（Zeta potential）测量和X射线光电子能谱（XPS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）及元素分析（CHNS/O）被用于证实阳离子改性的成功与否并测定取代度（Degree of Substitution）。原子力显微镜（AFM）和扫描电子显微镜（SEM）用于观察纤维形貌与泡沫微观结构。X射线显微计算机断层扫描（X-ray micro-computed tomography, XRµCT）被创新性地用于泡沫材料的三维结构重建，并对孔隙率、孔径大小及分布、孔道连通性等形貌参数进行非破坏性定量分析。材料的物理性质，如体积收缩率、体积密度和孔隙率也被一一测定。抗菌活性测试采用人类病原体大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α菌株作为模型微生物。将定量的不同泡沫样品置于含有初始浓度约为10^6 CFU/mL的大肠杆菌悬浮液中，在37°C下共培养18小时后，通过平板计数法评估上清液中剩余的菌落形成单位（Colony-Forming Units, CFU），并与无样品的对照组进行比较。测试还包含了未经干燥处理的CNFC水分散液作为最大化比表面积的对照。

主要研究结果

表面改性的成功验证是研究的基础。Zeta电位测量结果显示，原始NFC带负电（-16 mV），氧化后的ONFC仍为负电（-9 mV），而CNFC则呈现出+12 mV的正电性，这初步证实了阳离子基团的成功接枝。XPS分析在CNFC中检测到了含量为1.3 at.%的氮元素，这在NFC和ONFC中是不存在的，同时伴随着碳含量相对增加和氧含量相对减少，进一步证实了GRT分子的共价结合。FTIR谱图中，CNFC在1480 cm⁻¹（季铵基团甲基）、1411 cm⁻¹（C-N键）和1686 cm⁻¹（C=N双键）等位置出现特征吸收峰，为阳离子化提供了光谱学证据。元素分析定量结果显示，氧化步骤引入了0.60 mmol/g的醛基，而后续的阳离子化反应实现了0.25 mmol/g的有效阳离子取代度，相当于约42%的醛基被GRT修饰。AFM和SEM图像表明，在所选用的温和改性条件下，纤维的原始纳米级形态和完整性得以完好保留。

泡沫成型方案对材料物理性质和微观形貌具有决定性影响，是本研究的核心发现之一。蒸发干燥制备的CNFC_ED样品体积收缩率高达99.19%，形成密度为1270 mg/cm³、孔隙率仅15%左右的致密薄膜，XRµCT甚至无法检测到其内部孔隙，可归类为干凝胶（xerogel）。相比之下，所有经冷冻干燥的样品均形成了体积收缩率小（13%~48%）、密度极低（25~44 mg/cm³）且孔隙率极高（约97%~98%）的多孔整块冷冻凝胶。值得注意的是，通过不同冷冻速率精确调控了材料的孔径结构。快速冷冻得到的CNFC_RF样品，因其在极低温和高导热铜模具中瞬间形成大量细小冰晶，最终呈现平均孔径仅约30微米的精细孔隙结构。而缓慢冷冻条件下，冰晶有更充分的时间生长，CNFC_SF1和CNFC_SF7样品的平均孔径分别显著增大至约170微米和264微米。所有冷冻凝胶经XRµCT三维重建验证均具有高度连通的开放孔隙，其闭孔率低于1%。

抗菌活性的对比实验揭示了材料形貌对于抗菌效率的决定性作用。原始NFC制备的泡沫（NFC_SF1）与对照组相比，未显示出显著的抗菌活性，排除了纤维素本底的干扰。阳离子化赋予材料抗菌能力，但其效果强弱高度依赖于形貌。将CNFC_RF与致密的CNFC_ED相比，前者抗菌效率显著提升，这归因于高孔隙率带来的巨大有效接触表面积。然而，一个更具创新性的发现是，在孔隙率相当的情况下（约98%），CNFC_RF的抗菌性能却显著低于孔径更大的CNFC_SF1。这一看似矛盾的结果揭示了孔径的关键影响：当细菌细胞（尺寸约几微米）在材料内部迁移时，过小的孔道及其重叠形成的狭窄窗口会形成物理屏障，限制了细菌渗透进入材料内部，导致小孔材料内部的大面积阳离子表面无法被有效利用。SEM观察直观地证实了这一推测，在大孔的CNFC_SF1横截面内部发现了大量附着的大肠杆菌，而在小孔的CNFC_RF内部则鲜见细菌。CNFC_SF1展现出了最优异的抗菌效果，其大肠杆菌去除率比相同材质的致密薄膜（CNFC_ED）高出约85%，甚至与具有理论最大比表面积的、未干燥的CNFC水分散液（CNFC_ND）效果相当。继续延长冷冻时间至7天的CNFC_SF7样品，虽孔径更大，但其密度增加、孔隙率略有下降，导致抗菌性能呈轻微下降趋势，证实了CNFC_SF1为最佳平衡点。

研究结论与价值

本研究首次报道了通过GRT共价修饰NFC，成功制备出对大肠杆菌具有接触性抗菌活性的纯纤维素泡沫材料。研究有力地证明了一个重要科学观点：对于抗菌多孔材料而言，高孔隙率并非实现高效抗菌的充分条件；孔径大小和孔道连通性是同等重要、且需精心调控的关键形貌参数，因为它们直接决定了内部抗菌活性位点对微生物细胞的可及性。这一发现对材料科学领域具有重要的启示意涵，即优化材料功能时无需改变材料化学配方或合成路径，仅通过物理手段（如冰晶模板法）调控微观结构即可大幅提升其内在性能。

在应用层面，研究提出了一种全水相、无需有害化学品的环保制备工艺。筛选出的最佳样品CNFC_SF1不仅具有优异的抗菌性能，还表现出良好的吸水和耐水稳定性（溶胀度为24 g/g，在水中48小时后的质量保持率达88%），并展现出遇水即可恢复原始形状的形变记忆效应，这为其在空气/液体过滤、吸附净化、功能性缓冲材料以及医疗卫生和包装领域的实际应用与循环利用提供了巨大潜力。该研究为开发源于可再生资源的多功能高性能材料铺平了道路。

研究亮点

本研究的核心亮点在于其新颖的发现：在抗菌泡沫材料中，孔径的物理阻隔效应是决定其抗菌效率的一个独立且关键的变量，这一机制在此前被普遍忽视。研究者巧妙地结合了快速和慢速冷冻这两种冰晶模板技术，在不改变材料化学成分和总体孔隙率的前提下，构建出仅孔径大小不同的对比实验体系，并通过XRµCT这一高端成像技术对微结构进行了三维定量解析，最终将宏观抗菌性能的差异清晰地归因到微观孔径参数的差异上。这种“构效关系”的精准解耦与论证，是方法学上的精巧之处。此外，采用GRT通过席夫碱反应对纳米纤维素进行阳离子化，并将其直接整合进一个绿色、简捷的泡沫材料制备流程中，实现了材料多功能性的同步赋予与性能优化，这本身也代表了可持续抗菌材料设计的一个进步。