本研究由中国药科大学的Xusheng Yuan, Yannong Dou, Xin Wu, Zhifeng Wei*, Yue Dai*（通讯作者）共同完成，论文题为 “Tetrandrine, an agonist of aryl hydrocarbon receptor, reciprocally modulates the activities of Stat3 and Stat5 to suppress Th17 cell differentiation”，发表于 Journal of Cellular and Molecular Medicine 期刊（2017年，第21卷，第9期）。

学术背景 本研究属于免疫药理学领域，重点关注自身免疫性疾病，特别是类风湿性关节炎（RA）的潜在治疗机制。T辅助细胞17（Th17）是促炎性T细胞亚群，其过度分化和功能亢进与RA等自身免疫疾病的发生发展密切相关。信号转导与转录激活因子3（Stat3）是驱动Th17细胞分化的关键正性调节因子，而Stat5则被证明能抑制Th17细胞反应。芳烃受体（Aryl hydrocarbon receptor, Ahr）是一种配体依赖性转录因子，已知其激动剂（如环境污染物TCDD）可以抑制Th17细胞分化，但其具体分子机制尚不完全清楚。

汉防己碱（Tetrandrine）是一种从防己科植物粉防己根中提取的双苄基异喹啉类生物碱，前期研究表明它能够通过激活Ahr来抑制Th17细胞分化，从而缓解小鼠的胶原诱导性关节炎（CIA），但其作用的详细下游信号通路仍是未解之谜。鉴于Stat3和Stat5在Th17分化中的核心作用，以及Ahr可能与Stat蛋白存在交互作用，本研究旨在阐明：汉防己碱是否通过Ahr通路，以何种方式调控Stat3和Stat5的活性，从而实现对Th17细胞分化的抑制。

详细实验流程 本研究流程系统，结合了体外细胞实验和体内动物模型验证，主要包含以下几个关键部分：

1. 体外细胞模型的建立与初步机制探索：

   • 研究对象与样本量：从正常C57BL/6小鼠脾脏中分离出高纯度（>98%）的初始CD4+ T细胞作为研究对象。
   • 处理与实验：在Th17极化条件（抗CD3/CD28抗体刺激，同时加入TGF-β和IL-6）下，将细胞分为对照组、汉防己碱（0.1, 0.3, 1 μM）处理组以及TCDD（阳性对照，5 nM）处理组，培养72小时。
   • 检测方法：采用蛋白质印迹（Western blot）法检测Ahr及其靶基因Cyp1a1的表达，以确认汉防己碱的Ahr激动活性。同时，系统检测了Jak/Stat信号通路关键蛋白的磷酸化水平，包括p-Jak1/2/3， p-Stat1/3/5，以及内源性负调控因子Socs3。此外，通过免疫荧光技术观察了p-Stat3的核转位情况。

2. 验证Stat3与Stat5在汉防己碱效应中的必要性：

   • 研究对象与处理：在Th17极化体系中，分别加入Stat3激活剂（Colivelin）或Stat5抑制剂（HPA），观察它们能否逆转汉防己碱对Th17分化的抑制。
   • 检测方法：使用流式细胞术检测CD4+ T细胞中产生IL-17A的Th17细胞比例，并通过定量PCR（qPCR）检测Th17细胞关键转录因子Rorγt和效应细胞因子IL-17a的mRNA表达水平。同时，也检测了调节性T细胞（Treg）相关标志物Foxp3和IL-10，以排除汉防己碱通过促进Treg分化间接抑制Th17的可能性。

3. 明确Ahr在调控Stat3/Stat5活性中的核心作用：

   • 研究对象与处理：在细胞实验中，使用Ahr拮抗剂CH223191与汉防己碱共处理，或通过siRNA技术敲低Ahr的表达。
   • 检测方法：通过蛋白质印迹法检测这些干预措施对汉防己碱引起的p-Stat3降低和p-Stat5升高的影响。此外，使用Stat3抑制剂（CPT）和Stat5抑制剂（HPA）处理细胞，观察它们是否影响汉防己碱诱导的Ahr靶基因Cyp1a1表达，以判断Stat信号是否位于Ahr的上游。

4. 体内动物模型验证：

   • 研究对象与样本量：使用雄性DBA/1小鼠建立胶原诱导性关节炎（CIA）模型。当出现明显关节炎症状后，将小鼠分组（每组n=6），给予不同处理。
   • 处理：实验组包括：媒介物对照组、Ahr拮抗剂白藜芦醇（Resveratrol）组、汉防己碱组、汉防己碱+白藜芦醇共处理组。药物通过口服灌胃连续给药14天。
   • 检测方法：处死小鼠后，取脾脏和肠系膜淋巴结（MLNs）组织，通过免疫组织化学染色检测其中p-Stat3和p-Stat5的蛋白表达水平，验证体内汉防己碱通过Ahr调控Stat活性的效果。

5. 探究Ahr调控Stat活性的分子机制：

   • 研究对象：体外Th17极化条件下的初始CD4+ T细胞。
   • 实验方法：采用免疫共沉淀（Co-IP）技术，分析在汉防己碱处理下，Ahr蛋白是否与Stat3或Stat5蛋白发生直接结合。
   • 补充实验：通过细胞核质分离和蛋白质印迹，检测汉防己碱处理后p-Stat5在胞浆和胞核中的分布变化。

6. 阐明Stat3与Stat5活性变化之间的因果关系：

   • 研究对象与处理：在细胞实验中，使用Stat3抑制剂（CPT）或Stat5抑制剂（HPA）与汉防己碱共处理。同时，使用siRNA敲低Stat5的表达。
   • 检测方法：通过蛋白质印迹法，观察抑制或敲低Stat5后，汉防己碱对p-Stat3的抑制作用是否被逆转；以及抑制Stat3后，对汉防己碱引起的p-Stat5升高是否有影响，从而判断两者间的调控关系。

主要研究结果 1. 汉防己碱特异性调控Stat3和Stat5的磷酸化，而不影响上游Jak信号：体外实验结果显示，与TCDD类似，汉防己碱能显著激活Ahr（表现为Cyp1a1表达上调）。在Th17极化条件下，汉防己碱选择性地抑制了Stat3的磷酸化及其核转位，同时增强了Stat5的磷酸化。然而，它对Jak1、Jak2、Jak3的磷酸化水平以及Socs3的表达均无显著影响，表明其作用点位于Jak下游，直接针对Stat蛋白。

1. Stat3和Stat5的活性变化是汉防己碱抑制Th17分化的关键：流式细胞术和qPCR结果证实，汉防己碱显著降低了Th17细胞的比例以及Rorγt和IL-17a的基因表达，而这种抑制效应可被Stat3激活剂（Colivelin）或Stat5抑制剂（HPA）所部分抵消。这表明，Stat3活性的降低和Stat5活性的升高共同介导了汉防己碱的抑制效果。同时，汉防己碱在此条件下并不影响Treg细胞的分化，排除了其通过“促进Treg/抑制Th17”的间接模式起作用的可能性。

2. 汉防己碱对Stat3/Stat5的调控完全依赖Ahr的激活：当使用Ahr拮抗剂CH223191或敲低Ahr时，汉防己碱引起的p-Stat3降低和p-Stat5升高被几乎完全逆转。然而，使用Stat3或Stat5的抑制剂并不影响汉防己碱对Ahr的激活（Cyp1a1表达不变）。这清晰地证明，Ahr是汉防己碱作用的上游关键受体，Stat3/Stat5是其下游效应分子。

3. 体内实验证实了Ahr-Stat信号轴的存在：在CIA小鼠模型中，汉防己碱治疗显著降低了脾脏和MLNs组织中p-Stat3的水平，同时提高了p-Stat5的水平。口服Ahr拮抗剂白藜芦醇可以逆转汉防己碱的这种调控作用，这与体外细胞实验结果一致，有力地在疾病活体模型中验证了汉防己碱通过Ahr调控Stat3/Stat5活性的通路。

4. 分子机制：Ahr直接结合并激活Stat5，进而抑制Stat3：免疫共沉淀实验揭示了关键分子机制：汉防己碱（类似TCDD）能够促进Ahr蛋白与Stat5蛋白的直接结合，但并不与Stat3结合。这为汉防己碱增强Stat5活性提供了直接的分子解释。进一步的机制研究发现，Stat5抑制剂（HPA）或敲低Stat5能够逆转汉防己碱对p-Stat3的抑制作用，而Stat3抑制剂（CPT）却不影响汉防己碱对p-Stat5的促进作用。这表明，汉防己碱通过Ahr增强Stat5活性，而活化的Stat5进而负向调控Stat3的活性，最终形成一个级联抑制信号。

研究结论与意义 本研究得出结论：汉防己碱作为Ahr的激动剂，通过Ahr依赖性方式，以“双向调控”的模式抑制Th17细胞分化。其具体机制是：汉防己碱激活Ahr，促使Ahr与Stat5直接结合并增强其磷酸化活性；活化的Stat5转而抑制Stat3的磷酸化；Stat3活性的降低与Stat5活性的升高共同作用，最终导致驱动Th17分化的关键程序（如Rorγt表达）被抑制。

科学价值：该研究首次系统地阐明了汉防己碱抑制Th17细胞分化的详细信号转导通路，将Ahr的激活与Stat3/Stat5这一对在免疫平衡中起核心作用的“跷跷板”信号分子联系起来，深化了对于天然药物成分免疫调节机制的认识。它揭示了“Ahr-Stat5-Stat3”这一新的信号轴，为理解Ahr配体调控T细胞命运提供了新的分子视角。

应用价值：研究结果为将汉防己碱开发为治疗类风湿性关节炎等Th17相关自身免疫性疾病的药物提供了坚实的药理学理论基础。同时，提示靶向Ahr-Stat5-Stat3信号轴可能是治疗此类疾病的一个潜在新策略。

研究亮点 1. 机制阐述清晰深入：研究不仅发现了汉防己碱对Stat3/Stat5的调控现象，更深入阐明了其依赖Ahr的因果关系，并揭示了Ahr与Stat5直接结合的分子事件，以及Stat5抑制Stat3的级联关系，机制链条完整。 2. 实验设计系统严谨：结合了体外细胞分子机制探索与体内疾病模型验证，综合运用了激动剂/拮抗剂药理学工具、基因敲低技术、免疫共沉淀、核质分离等多种手段，证据相互支撑，说服力强。 3. 发现新颖性：明确提出并验证了汉防己碱通过Ahr“双向调控”（reciprocally modulate）Stat3和Stat5活性的新机制，强调了Stat3与Stat5活性“相对平衡”的重要性，而非简单的单一分子抑制。 4. 转化意义明确：所有研究均紧密围绕汉防己碱治疗CIA的疗效展开，机制研究与治疗应用直接关联，突出了研究的转化医学价值。