本研究由Ying Zhang（哥伦比亚大学生物医学工程系及杜克大学生物医学工程系）、Hanyao Huang、Jaewoo Lee、Jin-Young Hong、Jong-Wan Kim、Hon Fai Chan、Jung-Keun Hyun、Bruce A. Sullenger、Hae-Won Kim及Kam W. Leong等学者合作完成，发表于《Regenerative Biomaterials》期刊2026年第13卷，文章编号rbaf135，于2025年12月31日在线发表。

研究背景

无菌性炎症（sterile inflammation）在组织损伤、自身免疫病及多种病理状态中扮演关键角色。与微生物感染所引发的免疫应答不同，无菌性炎症的触发主要依赖内源性损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs），其中循环游离核酸（cell-free nucleic acids, cfNAs）是一类重要的DAMPs。当组织损伤、手术、移植或化疗导致大量细胞死亡时，基因组DNA、mRNA、线粒体DNA等核酸被释放至细胞外环境，这些核酸可被免疫细胞内的Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）识别，进而激活下游炎症信号通路，促进TNF-α、IL-6等促炎细胞因子的分泌。cfNAs在局部组织或系统循环中的升高与肌肉纤维化、骨关节炎、颞下颌关节紊乱（temporomandibular joint disorder, TMD）及系统性红斑狼疮等疾病密切相关。由于核酸本身携带负电荷，利用阳离子聚合物通过电荷相互作用捕获cfNAs已成为一种有前景的抗炎策略。然而，此前开发的阳离子纳米颗粒或可溶性阳离子聚合物虽然能够清除cfNAs，却因尺寸小或可在体内与cfNAs形成纳米复合物而被细胞摄取，存在重新激活细胞内TLR信号通路的潜在风险。因此，本研究提出将阳离子聚合物固定在微粒（microparticles）表面，利用微粒较大的尺寸限制其进入细胞，并凭借高表面积增强与核酸的结合能力，从而在阻断cfNAs诱导的炎症反应的同时避免细胞摄取的副作用。

研究流程

研究首先通过体外细胞实验验证了化学诱导细胞死亡后cfNAs的释放与炎症激活的关系。研究者选用HeLa、HepG2、A549和RAW 264.7四种细胞系，分别以凋亡诱导剂星形孢菌素（staurosporine, STS）或多柔比星（doxorubicin, DOX）处理，随后收集死亡细胞的上清液并定量其中cfDNA的含量。结果发现，不同细胞类型和药物处理条件下，cfNAs释放量存在显著差异，其中STS处理的RAW 264.7巨噬细胞释放的核酸量最高。为评估这些释放的核酸是否足以激活免疫应答，研究者将药物处理后的细胞上清液以1:5比例加入Ramos-Blue™报告细胞培养基中，观察到TLR活化显著增强，且活化强度与药物浓度相关。当加入DNase和RNase后，TLR活化被明显抑制，证明cfNAs是上清液中主要的免疫激活因子。

随后，研究者制备了阳离子微粒并测试其抑制cfNAs诱导TLR活化的能力。以商业聚苯乙烯微球为原理验证载体，通过静电层层自组装技术依次包被鱼精蛋白硫酸盐（protamine sulfate, PS）和肝素，表面zeta电位在正负值之间转换，证实了包被方案的可行性。在正式实验中，将PS、聚酰胺-胺树枝状聚合物（PAMAM）、25 kDa支链聚乙烯亚胺（PEI25k）、1.2 kDa聚乙烯亚胺（PEI1.2k）和聚-L-赖氨酸（poly-L-lysine, PLL）五种常用聚阳离子分别单独包被于微粒表面。这些包被后的微粒均能有效结合CpG寡核苷酸，结合效率呈浓度依赖性，且能阻止CpG被树突状细胞摄取。在Ramos-Blue™报告细胞体系中，阳离子微粒对CpG及poly(I:C)诱导的TLR9活化抑制效率接近90%。当CpG与抗单链DNA抗体F7-26形成免疫复合物时，TLR活化较游离CpG更强，而阳离子微粒可将该复合物诱导的TLR活化降低70%。对死亡细胞上清液及狼疮患者血浆这类内源性复杂核酸样本，阳离子微粒的抑制效率约为40%–60%，且抑制效果呈剂量依赖性。

在体内验证中，研究者首先构建了STS诱导的急性腹膜炎小鼠模型。C57BL/6小鼠腹腔注射STS后，腹腔灌洗液中cfNAs浓度、IL-6及TNF-α水平均明显升高，中性粒细胞浸润显著增加，炎症严重程度与STS剂量正相关。在STS注射后2小时给予PS包被微粒（单次给药）或分别在2小时和6小时两次给药，结果显示微粒治疗组的腹腔细胞因子水平和中性粒细胞数量均显著下降，且中性粒细胞抑制效果优于游离PS聚合物。

其次，研究者采用完全弗氏佐剂（complete Freund’s adjuvant, CFA）关节腔注射建立了大鼠颞下颌关节功能障碍模型。CFA注射三天后，向关节腔内注射不同剂量的PS包被聚苯乙烯微粒。组织学染色和micro-CT分析表明，0.8百万（M）微粒剂量即可在损伤后第5天和第10天较好地恢复软骨衬里结构，并促进骨体积增加；然而当剂量增加至4 M和20 M时，疗效反而下降。这些结果表明适当剂量的阳离子微粒能够缓解局部炎症并促进关节组织修复。

在脊髓损伤模型中，研究者对大鼠T9节段施加中度挫伤，并在损伤后30分钟将PS包被微粒原位注射至损伤部位。一周后的组织学染色显示，与对照组相比，微粒治疗组的损伤腔隙面积和病灶范围显著缩小。免疫荧光染色显示ED1+巨噬细胞浸润减少了约20%。此外，微粒治疗下调了iNOS、COX2、Nrf2等氧化应激相关基因以及p53和caspase 3等细胞凋亡介质的表达，提示微粒在抑制过度炎症的同时改善了损伤微环境。

为克服聚苯乙烯微粒不可生物降解的缺陷，研究者进一步开发了基于壳聚糖的阳离子微粒制备方法。利用微流控系统将两块芯片串联，生成水-油-水（W/O/W）双重乳液液滴，其中壳聚糖溶解于pH 5.2的醋酸钠缓冲液中作为内相。收集的液滴被转移至含10%甘氨酸的pH 10溶液中，壳聚糖因氨基去质子化而凝胶化，同时高渗透压驱动核心水分外流，3小时内脱水形成致密微凝胶颗粒。通过调控微流控通道尺寸和油水相流速比，可制备平均直径分别为6、10和16 μm的均匀壳聚糖微粒。后续通过肝素中间层包被聚阳离子外层，荧光共定位成像证实了层层包被的成功。与游离聚阳离子相比，固定化的PS对CpG的结合能力更强，其中PS包被的壳聚糖微粒结合效率最高。这些微粒能以剂量依赖方式抑制CpG诱导的TLR活化，也能抑制死亡细胞上清液诱导的TLR活化，且在高达200 μg/ml浓度下无细胞毒性。在TMD模型中，PS包被壳聚糖微粒与PS包被聚苯乙烯微粒均能恢复软骨衬里并增加骨体积，而游离PS聚合物无治疗效果。

主要结论与意义

本研究证实了聚阳离子包被微粒能够通过清除cfNAs并阻止其进入细胞，从而有效抑制无菌性炎症。在急性腹膜炎、颞下颌关节功能障碍和脊髓损伤三种动物模型中，阳离子微粒均降低了炎症细胞因子水平、减少免疫细胞浸润、保护组织完整性并促进组织修复。固定化聚阳离子策略显著降低了对高电荷密度聚阳离子的依赖，并降低了游离聚合物的系统毒性。基于微流控的壳聚糖微粒制备方法实现了粒径和表面性质的精确控制，为后续临床转化提供了更优的候选材料。

研究亮点

本研究的核心创新在于将聚阳离子固定于微米级载体表面，从机制上避免了可溶性或纳米级阳离子材料可能导致的核酸再摄取和细胞内TLR再激活问题。此外，微流控双重乳液技术制备的壳聚糖微粒具有高度均一性和可调控性，为核酸清除材料的设计提供了新途径。研究在多种病理模型中系统验证了该策略的广谱抗炎效果，具有良好的转化前景。该工作也为理解材料加工方式如何影响生物材料的生物学功能提供了实例。