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一、研究团队与发表信息
本研究由Daniel L. Dunkelmann、Carlos Piedrafita等来自英国剑桥MRC分子生物学实验室（Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology）的团队完成，于2024年1月18日发表在*Nature*期刊（Volume 625）上。通讯作者为Jason W. Chin。

二、学术背景与研究目标
研究领域为遗传密码扩展（genetic code expansion），旨在突破现有生物体翻译系统的限制。传统方法依赖正交氨酰-tRNA合成酶（orthogonal aminoacyl-tRNA synthetases, AARSs）将非经典氨基酸（non-canonical amino acids, ncAAs）加载到tRNA上，但需依赖核糖体翻译的反馈机制，导致无法兼容非核糖体底物（如β-氨基酸、α,α-二取代氨基酸等）。这种“进化僵局”（evolutionary deadlock）限制了遗传编码单体的化学多样性。本研究的目标是开发一种不依赖翻译反馈的直接筛选技术——tRNA展示（tRNA display），以突破这一限制。

三、研究流程与方法
1. tRNA展示技术的开发
- tRNA分割与组装：将Methanosarcina mazei的吡咯赖氨酰-tRNA（tRNAPyl）在反密码子环处分割为两部分（5′和3′片段），并通过设计10-12 bp的茎环结构实现细胞内自组装。
- 荧光与生物素标记技术：开发了fluoro-TReX（荧光标记）和bio-TReX（生物素捕获）方法，通过高碘酸盐氧化未酰化的tRNA 3′端，再以Klenow片段延伸标记，实现酰化tRNA的特异性检测（图1）。
- 基因型-表型关联：将tRNA 3′片段与吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（PylRS）的mRNA融合，构建stmRNAPyl（split tRNA-mRNA fusion），使酰化活性与合成酶基因直接关联（图3a）。

1. 正交合成酶的筛选与优化

   • 高通量筛选：通过bio-MReX（基于生物素捕获的mRNA扩展）从文库中富集能特异性酰化目标单体的PylRS突变体，结合下一代测序（NGS）分析富集度与选择性（图4a）。
     
   • 动态范围优化：通过调整核糖体结合位点（RBS）序列降低PylRS表达量，增强筛选灵敏度（图3e）。
     

2. 非经典单体的验证与应用

   • 单体类型：测试了8种非经典氨基酸（如含噻吩的ncAA 7）和8种非经典单体（ncMs，包括β-氨基酸、α,α-二取代氨基酸和β-羟基酸）（图5a）。
     
   • 蛋白质嵌入：在大肠杆菌中实现β-氨基酸（如(s)-β3-溴苯丙氨酸，13）和α,α-二取代氨基酸（如19）的位点特异性嵌入，产量达3-35 mg/L，并通过质谱和X射线晶体学（1.5 Å分辨率）验证结构（图5u）。
     

四、主要结果
1. 技术验证：
- fluoro-TReX和bio-TReX可灵敏检测tRNA酰化状态，动态范围覆盖低活性突变体（补充图3）。
- stmRNAPyl系统实现300倍富集活性PylRS突变体（图3d）。

1. 正交合成酶筛选：

   • tRNA display成功筛选出对β-氨基酸（如13）、α,α-二取代氨基酸（如19）和β-羟基酸（如20）特异的PylRS突变体（图5）。例如，PylRS(13_1evol1-3)对13的酰化效率显著提升（图5b-c）。
     

2. 翻译突破：

   • β-氨基酸嵌入导致GFP的β链发生构象扭结，但相邻氢键网络保持完整（扩展数据图6），证明其结构兼容性。
     
   • 部分ncMs（如17和20）因抑制翻译未被成功嵌入，提示需进一步优化核糖体适应性（图5r）。
     

五、研究结论与价值
1. 科学价值：
- 打破遗传密码扩展的“进化僵局”，首次实现β-氨基酸和α,α-二取代氨基酸的活体编码。
- 提供通用技术框架（tRNA display），可扩展至其他合成酶-tRNA系统。

1. 应用前景：
   
   • 设计抗蛋白酶蛋白或类药物分子（如含β-氨基酸的多肽）。
     
   • 为合成生物学中非经典聚合物（如折叠体foldamers）的活体合成奠定基础。
     

六、研究亮点
1. 方法创新：首创tRNA display技术，实现不依赖翻译反馈的合成酶直接筛选。
2. 化学多样性突破：将遗传密码扩展至β-氨基酸等新单体类别。
3. 结构生物学贡献：解析首个含β-氨基酸的蛋白质晶体结构（PDB ID: 8OVY）。

七、其他发现
- 通过定向进化提升PylRS(13_1)的活性（补充图33-34），证明tRNA display可迭代优化酶功能。
- 发现ncMs的嵌入效率具有位点依赖性（如GFP第150位可耐受β-氨基酸，而第3位不可）（补充图45），提示未来需研究序列上下文的影响。

该研究通过跨学科方法（生物化学、合成生物学、结构生物学）解决了遗传密码扩展的核心瓶颈，为生物医药和合成生物学提供了全新工具。