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脊髓缺血再灌注损伤中SYVN1通过调节HMGB1/NRF2/HO-1轴减轻铁死亡的作用及机制研究
一、研究作者、机构与发表信息
本研究由来自中国医科大学附属第一医院麻醉科的郭丽丽、张东、任晓燕以及中国医科大学附属盛京医院普通外科的刘丁胜（通讯作者）共同完成。该研究成果发表于Elsevier旗下期刊《International Immunopharmacology》（国际免疫药理学）第123卷，文章编号为110802，于2023年8月15日在线发表，DOI为10.1016/j.intimp.2023.110802。
二、研究背景与科学问题
脊髓缺血再灌注损伤（spinal cord ischemia–reperfusion injury, SCIRI）是胸腹主动脉瘤修复术中最具破坏性的并发症之一。其主要病理改变包括血脊髓屏障（blood spinal cord barrier, BSCB）损伤，进而引发炎症、细胞凋亡、兴奋性氨基酸毒性和钙超载等一系列级联反应，最终导致神经元死亡。近年来，铁死亡（ferroptosis）作为一种新发现的非凋亡性细胞死亡形式，被证实在缺血再灌注损伤中发挥重要作用。铁死亡的主要特征包括铁依赖性、脂质活性氧（reactive oxygen species, ROS）积累以及线粒体萎缩、膜密度增高等形态学改变。
Synoviolin 1（SYVN1）是一种定位于内质网的多跨膜RING指泛素连接酶，参与内质网相关蛋白的降解过程。已有研究表明，SYVN1在多种神经退行性疾病中具有潜在的神经保护作用，但其在SCIRI中的具体功能尚未明确。高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1, HMGB1）是一种高度保守的核DNA结合蛋白，在脊髓损伤后的神经元和小胶质细胞中显著上调，且与铁死亡过程密切相关。核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, NRF2）/血红素加氧酶1（heme oxygenase 1, HO-1）通路是细胞内重要的抗氧化应激信号轴，对铁死亡具有抑制作用。
因此，本研究旨在探讨SYVN1在SCIRI神经元铁死亡中的作用及其内在分子机制，重点关注SYVN1是否通过调控HMGB1/NRF2/HO-1轴来减轻脊髓缺血再灌注损伤。
三、研究设计与实验流程
本研究采用体外与体内实验相结合的策略，系统解析SYVN1在SCIRI中的功能与机制。体外实验部分，研究人员从胚胎期第16天（E16）的Sprague-Dawley（SD）大鼠中分离原代脊髓神经元，建立氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reperfusion, OGD/R）细胞模型以模拟SCIRI。首先，将原代脊髓神经元分别进行1小时、4小时和8小时的OGD处理，然后恢复24小时，检测细胞活力、ROS水平、丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）活性以及铁死亡相关蛋白GPX4、FTH1和PTGS2的表达，同时检测SYVN1蛋白表达变化，以确定SYVN1在OGD/R诱导的铁死亡中的表达趋势。接着，通过转染pCDNA-SYVN1过表达载体或si-HMGB1干扰片段，观察SYVN1过表达或HMGB1敲低对OGD/R诱导的神经元铁死亡的影响。铁死亡程度通过细胞活力、ROS和MDA水平、GSH-Px活性、GPX4/FTH1/PTGS2蛋白表达以及透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM）下观察线粒体形态来综合评估。
为明确SYVN1与HMGB1的分子关系，研究者利用在线预测软件UbiBrowser预测HMGB1的相互作用E3泛素连接酶，发现SYVN1是其中之一。随后通过免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）实验在293T细胞中验证了SYVN1与HMGB1的直接结合。进一步通过泛素化实验检测SYVN1对HMGB1泛素化水平的影响，并加入蛋白酶体抑制剂MG132以确认泛素化降解途径。此外，为探索SYVN1是否通过HMGB1调控NRF2/HO-1通路，研究者将OGD/R诱导的原代脊髓神经元分别用pCDNA-SYVN1单独处理、与MG132或pCDNA-HMGB1联合处理，以及pCDNA-SYVN1与pCDNA-HMGB1和NRF2激活剂富马酸二甲酯（dimethyl fumarate, DMF）联合处理，检测HMGB1、核内NRF2和HO-1蛋白的表达变化。
体内实验部分，研究者通过阻断SD大鼠左侧颈总动脉和主动脉弓远端10分钟后恢复灌注，建立SCIRI大鼠模型。将30只大鼠随机分为假手术组（sham）、SCIRI+空载体组（SCIRI+vector）和SCIRI+腺相关病毒介导SYVN1过表达载体组（SCIRI+Ad-SYVN1）。Ad-SYVN1通过鞘内注射方式于手术前7天给予，病毒滴度为5×10^13转导单位（TU）/ml，注射体积为2微升。术后通过Basso大鼠评分（Basso Rat Scale, BMS）和倾斜板试验评估大鼠运动功能恢复情况；通过Nissl染色观察脊髓前角神经元数量；通过免疫组化检测脊髓组织中SYVN1和HMGB1蛋白表达；通过Western blotting检测SYVN1、HMGB1、核内NRF2、HO-1及铁死亡相关蛋白GPX4、FTH1和PTGS2的表达；同时检测脊髓组织中的铁含量、ROS水平、MDA含量和GSH-Px活性。
四、主要研究结果
在体外实验中，随着OGD处理时间延长（1小时、4小时、8小时），原代脊髓神经元细胞活力逐渐下降，ROS和MDA水平逐渐升高，GSH-Px活性及GPX4和FTH1蛋白表达逐渐降低，PTGS2蛋白表达逐渐升高，SYVN1蛋白表达也呈时间依赖性下降。8小时OGD处理时上述变化最为显著。这些结果提示SYVN1表达下降与神经元铁死亡加重密切相关。
过表达SYVN1后，OGD/R诱导的神经元细胞活力明显恢复，ROS和MDA水平显著降低，GSH-Px活性以及GPX4和FTH1蛋白表达显著升高，PTGS2蛋白表达降低。TEM观察显示，OGD/R处理导致线粒体明显皱缩、膜密度增加、嵴减少或消失，而SYVN1过表达部分改善了这些线粒体形态异常，表明SYVN1过表达可抑制OGD/R诱导的神经元铁死亡。
分子机制方面，Co-IP实验证实SYVN1与HMGB1存在直接相互作用。泛素化实验显示，SYVN1过表达显著促进HMGB1的泛素化水平，而蛋白酶体抑制剂MG132处理则抑制了SYVN1介导的HMGB1泛素化，说明SYVN1通过泛素-蛋白酶体途径促进HMGB1降解。此外，SYVN1过表达或敲低均能相应改变HMGB1蛋白水平，但不影响HMGB1 mRNA表达，进一步证实了SYVN1对HMGB1的翻译后调控作用。
在OGD/R神经元中，SYVN1过表达可显著抑制HMGB1蛋白表达，并促进核内NRF2和HO-1蛋白表达。加入MG132或过表达HMGB1均可逆转SYVN1的上述效应。此外，NRF2激活剂DMF可消除HMGB1过表达对核内NRF2和HO-1蛋白表达的抑制作用。这些结果说明SYVN1通过促进HMGB1泛素化降解来激活NRF2/HO-1信号通路。进一步的干扰实验显示，HMGB1敲低可显著改善OGD/R诱导的神经元活力下降、ROS和MDA水平升高、GSH-Px活性下降以及GPX4和FTH1表达降低，并抑制PTGS2表达升高，同时减轻线粒体形态损伤，表明HMGB1敲低通过激活NRF2/HO-1通路抑制神经元铁死亡。
在体内实验中，与假手术组相比，SCIRI+vector组大鼠脊髓组织中SYVN1和HO-1蛋白表达显著降低，HMGB1蛋白表达显著升高。Ad-SYVN1过表达可显著增加脊髓组织中SYVN1和HO-1蛋白水平，降低HMGB1蛋白水平。Nissl染色显示，SCIRI后脊髓前角神经元数量明显减少，而SYVN1过表达组神经元数量显著增加。BMS评分显示，SCIRI+Ad-SYVN1组大鼠在损伤后3天起运动功能评分显著高于SCIRI+vector组。此外，SCIRI后脊髓组织中铁含量、ROS和MDA水平及PTGS2蛋白表达显著升高，GSH-Px活性及GPX4和FTH1蛋白表达显著降低。SYVN1过表达可显著逆转这些铁死亡相关指标的异常变化，表明SYVN1过表达可通过抑制铁死亡减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤。
五、研究结论与意义
本研究首次证明SYVN1在SCIRI大鼠和OGD/R诱导的原代脊髓神经元中表达下调，且SYVN1过表达可显著抑制神经元铁死亡并减轻脊髓缺血再灌注损伤。其内在机制是SYVN1作为E3泛素连接酶，通过直接与HMGB1结合并促进其泛素化降解，从而解除HMGB1对NRF2/HO-1通路的抑制作用，激活NRF2/HO-1抗氧化信号轴，最终抑制铁死亡。这一发现为SCIRI的治疗提供了新的分子靶点和策略方向，具有重要的科学价值和潜在临床应用前景。
六、研究亮点
本研究的亮点在于：首次阐明了SYVN1在SCIRI神经元铁死亡中的保护作用；首次证明SYVN1通过泛素化降解HMGB1来调控NRF2/HO-1通路；揭示了SYVN1/HMGB1/NRF2/HO-1轴在脊髓缺血再灌注损伤中的新机制；结合体外原代神经元OGD/R模型和体内SCIRI大鼠模型，从分子、细胞和整体动物水平系统验证了该机制。
七、其他有价值内容
研究还发现，HMGB1敲低可独立于SYVN1发挥抗铁死亡作用，且其效应依赖于NRF2/HO-1通路的激活，进一步支持了HMGB1作为铁死亡关键调控因子的观点。此外，本研究采用了BODIPY581/591C11脂质过氧化双荧光探针和透射电子显微镜等多种手段综合评价铁死亡，提高了研究结论的可靠性。