本研究由来自普渡大学药学院工业与物理药学系的 Sakchai Wittaya-Areekul 和 Steven L. Nail，以及礼来研究实验室药物开发部门的 Gregory F. Needham、Nathaniel Milton 和 Michael L. Roy 共同完成，发表于 Journal of Pharmaceutical Sciences 第 91 卷第 4 期，出版时间为 2002 年 4 月。该研究属于药剂学与冷冻干燥技术领域，针对妥布霉素硫酸盐在叔丁醇（tert-butanol，TBA）/水共溶剂体系中的冷冻干燥行为进行了系统研究，旨在解决临床上对可倾倒无菌粉末的制剂需求。

妥布霉素是一种主要用于治疗革兰氏阴性菌感染的氨基糖苷类抗生素，其硫酸盐形式常以无菌溶液或无菌粉末供临床使用。在骨科手术中，妥布霉素硫酸盐无菌粉末需与骨水泥混合，以预防术后感染。该应用的关键质量属性是粉末应具有良好的流动性和可倾倒性，能够从西林瓶中方便地倒出。然而，直接以水为溶剂进行冷冻干燥所得到的固体坚硬，振摇后不易破碎，无法满足直接灌装和倾倒的要求。传统工艺需经过复杂的无菌粉末制备与分装步骤。为此，本研究探索使用叔丁醇/水共溶剂体系进行冷冻干燥，以期直接获得振摇后即松散成粉的冻干产品。研究重点在于明确影响冻干固体物理性质及残留溶剂水平的关键制剂变量和工艺变量。

在实验方法上，研究首先以妥布霉素碱为原料，通过硫酸滴定制备妥布霉素硫酸盐溶液，并在滴定后加入叔丁醇以避免共溶剂体系中对 pH 的不确定性。热分析采用温度调制差示扫描量热仪对溶液及冻干粉末进行表征，样品从室温冷却至-60°C，冷却速率范围为 0.1 至 5°C/min，升温速率通常为 1°C/min。冷冻干燥实验在配备取样装置的实验室冻干机中进行，使用 T 型热电偶监测样品温度。系统考察了初始叔丁醇浓度、降温速率、退火条件以及二次干燥温度和时间对残留叔丁醇水平的影响。残留水分采用卡尔·费休滴定法测定，残留叔丁醇和异丙醇采用气相色谱法测定，并配有火焰离子化检测器。冻干固体的结晶状态通过 X 射线粉末衍射确认，均表现为无定形。冻干饼块的易碎性通过手动振摇或轻敲西林瓶评估，以能否形成松散粉末并完全倒出为可接受标准。

研究结果首先表明，在避免冷冻过程中发生相分离的前提下，叔丁醇/水共溶剂体系能够有效制备振摇后即可形成松散粉末的冻干产品。差示扫描量热分析显示，妥布霉素硫酸盐体系中叔丁醇比妥布霉素碱体系更容易在冷却过程中结晶。妥布霉素碱体系的玻璃化转变温度约为-33°C，升温过程中出现代表叔丁醇结晶的放热峰；而妥布霉素硫酸盐体系无该放热峰，且其叔丁醇/冰共晶熔融吸热峰更加尖锐，说明结晶更完全。这一差异与残留叔丁醇水平密切相关。在相同叔丁醇初始浓度（5%）和药物浓度（12%）条件下，妥布霉素碱冻干品中残留叔丁醇为 6.0%–7.0%，而妥布霉素硫酸盐冻干品中仅为 0.98%–1.2%。其机制在于叔丁醇结晶后可通过升华和蒸汽整体流动快速去除，而未结晶而分散于无定形相中的叔丁醇则需要通过固体内扩散和表面蒸发移除，去除效率显著降低。

研究进一步考察了液相-液相相分离现象。在室温下，当叔丁醇浓度高于 20% 且妥布霉素硫酸盐浓度高于 12% 时，溶液会分为富妥布霉素硫酸盐相和富叔丁醇相。即便在 10% 叔丁醇和 12% 妥布霉素硫酸盐条件下溶液室温表现为单相，冻干固体仍会出现两层结构。相分离不仅导致外观不合格，还使冻干固体不易振摇破碎、残留叔丁醇水平升高、复溶时间延长。通过系统改变药物和叔丁醇浓度，研究确定了相分离边界。叔丁醇浓度低于 8% 且妥布霉素硫酸盐浓度低于 8% 时，冷冻体系为单相。该结果表明，为避免相分离，需将两者浓度控制在单相区以内。基于此，后续实验选择了 8% 妥布霉素硫酸盐和 5% 初始叔丁醇的组合，冻干后残留叔丁醇水平约为 0.6%。

在制剂变量对残留叔丁醇的影响方面，恒定初始叔丁醇浓度为 9% 时，妥布霉素硫酸盐浓度在 8%–10% 范围内残留叔丁醇无显著差异，约为 0.65%–0.78%；但当药物浓度升至 11% 时，残留叔丁醇显著升高，提示可能已出现肉眼不易察觉的微小相分离。当固定妥布霉素硫酸盐浓度为 11% 时，初始叔丁醇浓度从 5% 增至 9%，残留叔丁醇在 5%–8% 范围内无显著差异，但 8%–9% 区间差异显著，同样归因于高浓度下的微小相分离。这些数据支持残留叔丁醇最小化需要避开相分离区域的结论。

二次干燥条件的研究表明，延长二次干燥时间并提高温度对降低残留叔丁醇水平没有显著效果。在 25°C/10 h 与 35°C/48 h 两种二次干燥条件下，不同初始叔丁醇浓度和不同妥布霉素硫酸盐浓度样品的残留叔丁醇水平均无显著改善。这表明当体系水分含量降至极低时，残留叔丁醇被固定或包埋于无定形固体的微区域中，扩散极为缓慢，二次干燥无法有效移除。这与早期关于蔗糖体系残留叔丁醇的研究结果一致。

冷冻历史对残留叔丁醇的影响是该研究的关键内容之一。通过液氮快速冷冻的样品残留叔丁醇超过 1.5%，显著高于慢速冷却和预冷搁板冷冻的样品。原因在于快速冷却使体系温度迅速降至玻璃化转变温度以下，黏度急剧增加，限制了叔丁醇的晶体生长。而在冷却至-45°C 后升温至-20°C 退火，残留叔丁醇可降至约 0.3%。该退火温度位于玻璃化转变温度与叔丁醇/冰共晶熔点之间，有利于低温下成核及退火过程中的晶体生长。相比之下，在冷却过程中于-20°C 或-30°C 保温退火并未显著降低残留叔丁醇。这些结果说明，先经历低温成核、再在玻璃化转变温度以上进行晶体生长的退火策略对叔丁醇结晶最有利。异丙醇作为叔丁醇原料中的少量杂质，其残留行为与叔丁醇不同。液氮快速冷冻由于产生更小的冰晶和更高的干燥固体比表面积，反而使异丙醇残留最低；退火因促进冰晶和叔丁醇晶体生长，减少了可用于蒸发的表面积并增加了扩散路径，导致异丙醇残留较高。这表明不同挥发组分的去除机制受其是否随冷冻而结晶的影响。

综合来看，本研究证明叔丁醇/水共溶剂体系可用于制备振摇后即松散、可倾倒的妥布霉素硫酸盐冻干粉末。成功的关键在于避免液相-液相相分离，并确保叔丁醇在干燥前充分结晶。制剂组成应处于单相区域，冷冻工艺应避免过快的液氮淬冷，并通过在玻璃化转变温度以上进行退火以促进叔丁醇晶体生长。二次干燥无法弥补冷冻过程中结晶不充分造成的残留溶剂升高。本研究为共溶剂冷冻干燥技术在无菌粉末制剂中的应用提供了系统的理论依据和工艺指导，对改善骨科手术中抗生素粉末的临床使用便利性具有直接意义。