本研究由徐州医科大学生命科学学院生物物理学系的Zhiqiang He、Huan Yang、Yufan Gu等研究者，联合药学院及江苏省新药研究与临床药学重点实验室的Maofang Zhao、Yipeng Pang、Yi Liu等人共同完成，发表于 International Journal of Nanomedicine 2023年第18卷4857至4870页。该研究聚焦于纳米医学领域中的抗菌材料设计与应用，旨在通过金属有机框架（metal organic framework, MOF）介导的绿色合成策略，构建一种pH敏感型纳米复合材料AgNPs@ZIF-8，以改善纳米银（AgNPs）在抗菌应用中存在的易团聚和高细胞毒性等缺陷。
一、研究背景与目的
随着抗生素的广泛使用甚至滥用，致病微生物的耐药性问题日益严峻，尤其广谱抗生素的耐药现象已对人类健康构成严重威胁。因此，开发新型高效、广谱且不易诱导耐药的无机抗菌剂成为亟需解决的课题。纳米银因其广谱抗菌活性、高稳定性及强表面活性而在医疗器械和废水处理等领域表现出巨大潜力。然而，AgNPs在生物体内过量释放银离子可能引起呼吸系统和肝脏的轻度损伤，且其易沉淀、高细胞毒性的缺陷限制了其临床应用。金属有机框架材料具有可调节孔径、良好生物可降解性、良好分散性和低毒性等特点，其中沸石咪唑酯骨架-8（zeolitic imidazolate framework-8, ZIF-8）因其pH响应性降解能力和固有抗菌性能而受到关注。ZIF-8中的锌离子可进入细菌内部破坏细胞膜，同时咪唑基团在弱酸环境下与锌离子的配位作用发生解离，从而赋予材料pH敏感的释放特性。基于此，本研究提出将AgNPs负载于ZIF-8上形成AgNPs@ZIF-8纳米复合物，期望利用ZIF-8的载体功能和pH响应特性，在降低AgNPs用量的同时增强其抗菌效果，并减少细胞毒性。
二、研究流程与实验方法
研究首先通过绿色合成方法制备了ZIF-8载体：将Zn(CH₃COO)₂与2-甲基咪唑（2-mim）在甲醇溶液中混合搅拌，超声处理并离心洗涤，真空干燥后得到ZIF-8。随后以艾叶提取物为还原剂，在ZIF-8存在下与AgNO₃反应，通过沸水浴加热1小时并过滤，得到不同Ag与ZIF-8质量比（0.20:1、0.25:1、0.30:1、0.35:1、0.40:1）的AgNPs@ZIF-8纳米复合物。材料表征方面，利用扫描电子显微镜（SEM）观察形貌，确认ZIF-8呈现则十二面体结构且AgNPs分散在其表面；紫外-可见光谱（UV-vis）显示AgNPs@ZIF-8同时具有ZIF-8约285 nm和AgNPs约433 nm的吸收峰，且组装过程中出现红移；傅里叶变换红外光谱（FTIR）在3376 cm⁻¹处吸收增强以及767 cm⁻¹处出现新峰，提示Ag⁺与咪唑环发生相互作用；粒径分析显示AgNPs、ZIF-8和AgNPs@ZIF-8的平均粒径分别约为89.8 nm、335.3 nm和236.1 nm；Zeta电位分别为1.39 mV、0.79 mV和2.69 mV。上述结果共同证实AgNPs成功负载于ZIF-8上。
在抗菌性能评价中，研究选取大肠杆菌（*Escherichia coli*）、金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）和鲍曼不动杆菌（*Acinetobacter baumannii*）三种临床常见致病菌作为研究对象。通过细菌生长曲线实验比较不同材料在1 μg/ml和2 μg/ml浓度下对细菌生长的抑制作用，结果显示ZIF-8在低浓度下无显著抗菌能力，AgNPs具有一定抑制作用，而AgNPs@ZIF-8对革兰氏阴性和阳性菌的抑制效果均显著优于同等浓度的ZIF-8和AgNPs。随后通过微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）和最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration, MBC）以筛选最佳负载比例。结果显示AgNPs0.20@ZIF-8对三种细菌的MIC均为32 μg/ml；AgNPs0.25@ZIF-8、AgNPs0.30@ZIF-8和AgNPs0.35@ZIF-8对三种菌的MIC均为16 μg/ml；AgNPs0.40@ZIF-8的MIC为8 μg/ml。在MBC实验中，AgNPs0.25@ZIF-8对大肠杆菌和鲍曼不动杆菌的MBC均为64 μg/ml，对金黄色葡萄球菌为32 μg/ml；AgNPs0.20@ZIF-8的MBC则为64~128 μg/ml；AgNPs0.40@ZIF-8的MBC为16~32 μg/ml。为评估生物相容性，研究采用HT22小鼠海马神经元细胞进行CCK-8细胞活力实验，结果显示不同负载比例材料在5 μg/ml和10 μg/ml浓度下细胞活性随AgNPs比例增加而下降；其中AgNPs0.25@ZIF-8在MIC浓度下细胞活性约为60%，综合抗菌性能和细胞毒性表现最优，被选为后续机制研究的对象。
进一步，研究通过体内感染模型验证AgNPs@ZIF-8的抗菌保护效果。以大蜡螟（*Galleria mellonella*）幼虫为实验对象，分为生理盐水组、药物处理组、菌液处理组和菌液与药物混合处理组，每组15只。注射后连续7天记录死亡率，结果显示菌液处理组死亡13只，混合处理组死亡9只，经log-rank分析表明药物处理可显著降低感染幼虫的死亡率，且药物本身无显著毒性。在pH环境对抗菌效果影响的研究中，通过调节MHB培养基pH至6.4、7.4和8.4模拟不同感染微环境。结果表明AgNPs@ZIF-8在碱性（pH=8.4）和中性（pH=7.4）条件下对三种细菌的抑制能力无显著差异，但在弱酸性（pH=6.4）环境中抗菌活性更为突出，细菌生长受到更明显抑制。该结果提示弱酸性条件有利于ZIF-8降解释放Zn²⁺和Ag⁺，进而协同增强抗菌性能。
在抗菌机制研究方面，研究利用活性氧（reactive oxygen species, ROS）荧光探针H₂DCF-DA检测细菌胞内ROS水平。结果显示经8 μg/ml AgNPs0.25@ZIF-8处理后，大肠杆菌胞内绿色荧光强度约为对照组的2倍（对照组约0.8 a.u.，处理组约1.6 a.u.），表明该纳米复合物可显著诱导细菌内ROS水平升高，造成氧化应激损伤。在生物被膜清除实验中，通过对结晶紫染色后的生物被膜进行OD620测定发现，AgNPs@ZIF-8对大肠杆菌的生物被膜清除50%所需浓度（bec50）为1/2×MIC，而对金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌的bec50均为1×MIC，说明该材料对细菌生物被膜具有良好清除能力，能够破坏已形成的致病菌生物被膜结构。
三、主要结果与结论
综合以上实验，研究成功制备了粒径均一、形貌规则的AgNPs@ZIF-8纳米复合物，并通过多种表征手段验证了AgNPs在ZIF-8上的有效负载。抗菌实验证实，AgNPs@ZIF-8对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌均表现出优于单纯AgNPs的广谱抗菌活性。在质量比为1:0.25时，AgNPs@ZIF-8兼具较低的细胞毒性和较高的抗菌效率，被确定为最佳配比。该纳米复合材料在弱酸性环境中抗菌效果更加显著，且能有效清除细菌生物被膜并提高细菌胞内ROS水平。体内大蜡螟感染模型进一步验证了AgNPs@ZIF-8在活体中的抗菌保护作用和安全性。
四、研究意义与价值
本研究的科学价值在于构建了一种基于MOF的pH响应型纳米抗菌递送系统，通过ZIF-8负载AgNPs有效克服了纳米银易聚集和高毒性的缺陷，并在较低AgNPs用量下实现了增强的抗菌性能。其应用价值体现在为临床耐药菌感染治疗提供了新的非抗生素策略，特别适用于弱酸性感染微环境中的局部抗菌治疗。此外，该研究揭示了ZIF-8与AgNPs协同抗菌的可能机制，即弱酸条件下ZIF-8降解释放Zn²⁺增加细菌膜通透性，促进Ag⁺进入细菌内部，同时诱导ROS升高和生物被膜破坏，从而实现对多种致病菌的高效抑制。
五、研究亮点
本研究的亮点包括：利用绿色合成方法制备AgNPs@ZIF-8，避免了有毒还原剂的使用；系统筛选了最佳AgNPs负载比例，兼顾了抗菌性能与生物安全性；首次从pH响应角度探讨了AgNPs@ZIF-8在不同酸碱环境下抗菌效果的差异及可能机制；通过体内外实验结合验证了材料的抗菌有效性，为后续纳米抗菌药物的开发提供了理论依据和实验基础。