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本研究报告所依据的论文由来自波兰托伦尼古拉·哥白尼大学化学系环境化学与生物分析教研室及位于华沙的Masdiag诊断质谱实验室的研究人员共同完成。第一作者为R. Rola，通讯作者亦为R. Rola，合作者包括K. Kowalski、T. Bieńkowski及S. Studzińska。该研究于2020年8月9日在线发表于*Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis*第190卷，文章编号为113529。

在学术背景方面，维生素D代谢物的定量分析是临床检验中的重要内容。尽管超过90%的维生素D检测使用免疫酶学技术，但液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）因其对目标代谢物分析的特异性和选择性而被视为参考方法。维生素D在体内主要以与维生素D结合蛋白（VDBP）和白蛋白结合的形式存在于血浆中，分别约占85%和15%。其中，总25(OH)D——即25(OH)D₃与25(OH)D₂之和——被公认为最具临床实用价值的生物标志物，可用于诊断维生素D缺乏症和监测补充治疗反应。此外，24,25(OH)₂D₃与25(OH)D₃的比值，即维生素D代谢物比值（VMR），可作为特异性分解代谢标志物，并有助于识别特发性婴儿高钙血症（IIH）患者。然而，24,25(OH)₂D₃的检测只能通过LC-MS/MS实现，且其浓度与25(OH)D₃相关，在25(OH)D₃水平较低的人群中，该代谢物的准确定量尤为重要。现有样品前处理方法通常包括皂化、蛋白沉淀、液液萃取、固相萃取或支持液体萃取等步骤，普遍存在耗时、费力、难以自动化、需消耗大量有机溶剂或回收率不足等问题。因此，本研究旨在开发一种基于蛋白沉淀（PP）的快速、廉价且高通量的血清样品前处理方法，并改进液相色谱分离条件，以解决以往方法中24,25(OH)₂D₃代谢物出现假阳性信号的问题。

在研究流程方面，作者首先比较了液液萃取结合蛋白沉淀（LLE/PP）与单独蛋白沉淀两种前处理策略。LLE/PP方法中，向100微升血清中加入10微升内标混合物孵育30分钟，然后加入100微升0.2 M硫酸锌溶液和200微升甲醇进行蛋白沉淀，再用400微升己烷或乙酸乙酯进行两次液液萃取，合并萃取液后用氮气吹干，进行Cookson型试剂DAPTAD衍生化反应，最后复溶并进样分析。结果显示，使用己烷作为萃取剂时，单羟基代谢物的回收率为88%–97%，但双羟基代谢物如24,25(OH)₂D₃的回收率仅为20%，1,25(OH)₂D₃仅为3%；改用乙酸乙酯后回收率虽有所提高，但乙酸乙酯与甲醇完全互溶，无法实现有效的样品净化，且该方法操作步骤繁琐。因此，作者放弃了LLE/PP方案，转而开发以单独蛋白沉淀为核心的前处理方法。在PP方法开发中，作者在96孔聚丙烯板中使用50微升血清，测试了乙腈、丙酮、甲醇、乙醇及其与硫酸锌或甲酸的多种组合。结果表明，乙腈、丙酮及乙腈-丙酮混合物对维生素D代谢物的回收率最高，为80%–88%，但丙酮挥发性强且重复性差，最终选择乙腈作为沉淀剂。进一步考察乙腈与血清的体积比时发现，一次加入全部乙腈会导致回收率低且变异大，推测原因是沉淀过快使蛋白结合态代谢物未能充分释放。因此，作者改用两步沉淀策略，即先加入50微升含内标的乙腈使代谢物从蛋白复合物中释放，再加入350微升乙腈使蛋白完全沉淀，最终乙腈与血清比例为8:1。为优化第一步中有机溶剂的比例，作者系统研究了初始有机溶剂含量从1%到91%范围内对回收率和内标峰面积的影响。结果表明，只有初始有机溶剂含量在30%–70%之间时，维生素D代谢物才能完全从蛋白复合物中释放；低于31%时释放不完全，高于70%时蛋白过快且大量沉淀导致回收率显著下降。此外，当有机溶剂含量在80%–90%范围内时，内标峰面积的标准偏差最大，提示基质效应增加，可能与脂质类物质的释放及电喷雾电离抑制有关。在孵育条件优化中，作者比较了30 g和60 g两种振摇速度及10、20、30分钟三个时间点，发现30 g条件下目标峰面积比60 g低50%，因此选择60 g振摇30分钟。复溶体积实验中，作者分别测试50、100、150、200微升四种体积，发现峰面积随复溶体积增加呈非线性下降，但所有体积均满足信噪比大于10的要求，最终选择150微升以避免样品溢出并保持足够灵敏度。在色谱分离方面，作者比较了两种不同化学结构的色谱柱，即Eclipse XDB-C18（1.7 μm，50×4.6 mm）和ACE C18-AR（3 μm，100×2.1 mm）。两者均可将24,25(OH)₂D₃与干扰物25,26(OH)₂D₃分离，但XDB-C18柱的总分析时间为5.5分钟，几乎比C18-AR柱的10分钟缩短了一半，同时保持了3-epi-25(OH)D₃与25(OH)D₃的分离度。最终采用XDB-C18柱，流动相为含0.1%甲酸的水和乙腈，流速0.8 mL/min，梯度洗脱程序在5.5分钟内完成。定量分析采用多反应监测（MRM）模式，并使用了¹³C₅标记的25(OH)D₃内标替代氘代内标，以避免氢/氘交换反应并改善保留时间一致性。在方法验证中，校准曲线在全部范围内线性良好。24,25(OH)₂D₃、25(OH)D₂和3-epi-25(OH)D₃的动态范围为0.1–10 ng/mL，25(OH)D₃的动态范围为1–100 ng/mL。各代谢物的检测限（LOD）分别为0.01、0.09、0.02和0.02 ng/mL，定量限（LOQ）分别为0.05、0.44、0.10和0.08 ng/mL。日内精密度为3%，日间精密度为6%。准确度为91%–95%。回收率、基质效应和过程效率通过四组样品进行评价，结果显示25(OH)D₃、25(OH)D₂、3-epi-25(OH)D₃和24,25(OH)₂D₃的以内标校正后的回收率分别为97.1%、91.7%、95.6%和98.5%，过程效率为84%–99%。其中25(OH)D₂的基质效应最大，与磷脂共流出有关。通过监测常见磷脂的MRM离子对，作者发现25(OH)D₂与部分磷脂共洗脱，但每个分析物均有其对应的同位素内标，因此基质效应和保留时间偏移可被有效校正。

在主要结果方面，研究首先证实了传统LLE/PP方案对双羟基维生素D代谢物回收率不足的缺陷，特别是己烷萃取对24,25(OH)₂D₃和1,25(OH)₂D₃的回收率极低，这构成了样品前处理方法改进的直接动机。随后，通过对不同有机沉淀剂的系统筛选，确立了乙腈作为最优沉淀剂，并进一步发现两步蛋白沉淀策略能够显著提高回收率，其中24,25(OH)₂D₃的回收率达到97%，25(OH)D₃为100%，25(OH)D₂为104%，3-epi-25(OH)D₃为100%。这一结果说明，蛋白沉淀过程中代谢物从蛋白复合物中的渐进释放是保证高回收率的关键。有机溶剂含量与回收率关系实验的结果表明，30%–70%的初始有机溶剂含量是维生素D代谢物完全释放的适宜范围，这一发现为蛋白沉淀前处理方法中沉淀剂添加策略的优化提供了重要的理论依据。色谱柱比较实验的结果表明，小粒径的C18柱可以在更短时间内实现同等甚至更好的分离效果，从而在保持分离度的情况下将分析时间缩短近一半。该色谱方法成功消除了24,25(OH)₂D₃代谢物的假阳性信号，这对准确诊断特发性婴儿高钙血症、避免高估双羟基代谢物水平具有直接临床意义。方法学验证结果显示该方法的灵敏度、精密度、线性、准确度及回收率均满足生物分析方法学验证的相关要求，且样品前处理时间仅约一个半小时，包括衍生化反应。

在结论方面，作者指出，本研究成功开发了一种仅基于蛋白沉淀的血清样品前处理方法，无需进一步的液液萃取或固相萃取步骤，即可高效提取维生素D代谢物。该方法具有样品用量少、操作简单、成本低、易于自动化和高通量的特点，适用于临床常规LC-MS/MS分析。更重要的是，研究首次系统揭示了有机溶剂含量对蛋白结合态维生素D代谢物释放效率的影响规律，即只有初始有机溶剂含量维持在30%–70%范围内，代谢物才能从结合蛋白中完全释放，过少或过多均会降低回收率和重复性。此外，改进后的色谱方法在5.5分钟内实现了对目标代谢物及异构体形式的充分分离，并消除了24,25(OH)₂D₃的假阳性信号，这对避免临床结果高估和准确识别特发性婴儿高钙血症患者具有重要意义。

本研究的亮点包括：第一，首次系统研究了蛋白沉淀过程中有机溶剂比例与维生素D代谢物释放效率及基质效应之间的关系，为样品前处理优化提供了新的理论认识；第二，建立了仅依靠蛋白沉淀即可实现高回收率和高通量的血清前处理方案，省去了传统LLE或SPE步骤，显著节约时间和成本；第三，通过使用小粒径C18色谱柱和¹³C标记内标，在缩短分析时间的同时提高了分离度和定量稳定性；第四，成功排除了25,26(OH)₂D₃对24,25(OH)₂D₃的干扰，消除了检测假阳性问题，提升了临床诊断的可靠性。

此外，研究还强调了对双羟基化维生素D代谢物进行充分色谱分离的重要性。由于体内存在多种结构相似的双羟基代谢物，如25,26(OH)₂D₃，常规色谱方法可能导致24,25(OH)₂D₃定量结果被高估，特别是在25(OH)D₃水平较低或CYP24A1基因突变的患者中。因此，在临床常规检测中有必要采用具有足够分离度的色谱方法，以准确区分这些代谢物并避免误判。