类型a
主要作者与机构及发表信息
该研究由Lili Wang、Jeff Smith、Derek Jantz和James M. Wilson等人主导，其中James M. Wilson来自宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院基因治疗项目（Gene Therapy Program, Department of Medicine, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania），而Jeff Smith和Derek Jantz则来自Precision BioSciences公司。这项研究于2018年7月9日在线发表在《Nature Biotechnology》期刊上。
学术背景
该研究属于基因组编辑领域，旨在探索通过体内基因组编辑技术治疗人类遗传疾病的可能性。高胆固醇血症是一种常见的代谢性疾病，其特征是低密度脂蛋白（LDL）水平升高，增加心血管疾病的风险。PCSK9（前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型）是一种分泌蛋白，通过抑制LDL受体的表达来调节胆固醇水平。因此，失活PCSK9成为一种潜在的治疗策略。尽管CRISPR-Cas9等工具已在小鼠模型中展示出高效的基因组编辑能力，但非人灵长类动物中的研究仍较为有限。本研究的目标是评估AAV8载体递送工程化大核酸酶（meganuclease）在非人灵长类动物肝脏中对PCSK9的编辑效果，并探讨其安全性和有效性。
详细研究流程
研究分为多个步骤，主要包括以下内容：
构建和筛选大核酸酶
研究团队基于I-CreI同源内切酶设计了一种针对PCSK9外显子7的大核酸酶M1PCSK9。通过结构重设计，M1PCSK9能够识别并切割PCSK9基因的特定序列。为了验证其活性，研究人员在HEK-293细胞中进行了电转实验，并通过测序确认了其靶向效率。随后，他们开发了第二代大核酸酶M2PCSK9，以减少脱靶效应。
动物实验设计
研究使用了恒河猴（Rhesus macaques）作为实验对象，共包括6只成年猴。这些猴子接受了不同剂量的AAV8-M1PCSK9或AAV8-M2PCSK9载体注射。剂量范围为2.0 × 10^12至3.0 × 10^13 GC/kg。注射后，研究人员定期采集血液样本和肝组织活检样本，用于分析PCSK9水平、血脂水平以及基因组编辑效率。
实验方法与数据分析
体外实验验证
研究团队还利用诱导多能干细胞（iPSC）衍生的肝细胞作为体外模型，进一步验证了M2PCSK9的活性和安全性。这些细胞被AAV6.2-M2PCSK9载体转导，并通过GUIDE-Seq技术分析脱靶效应。
主要结果
1. PCSK9基因编辑效果
在恒河猴中，AAV8-M1PCSK9和AAV8-M2PCSK9均实现了剂量依赖性的PCSK9基因编辑。高剂量组（3.0 × 10^13 GC/kg）的PCSK9水平降低了84%，而中剂量组（6.0 × 10^12 GC/kg）和低剂量组（2.0 × 10^12 GC/kg）分别降低了45%和28%。相应的LDL水平也显著下降，高剂量组和中剂量组分别降低了60%和48%。
基因组编辑持久性
尽管载体DNA和大核酸酶表达在注射后迅速下降，但基因组编辑效果在肝细胞中保持稳定。AMP-Seq数据显示，大多数编辑位点在第二次活检时仍然存在，表明编辑效果具有长期稳定性。
脱靶效应分析
GUIDE-Seq技术鉴定了数百个潜在的脱靶位点，但深度测序验证显示，仅少数位点在猴肝组织中表现出显著的编辑活性。第二代大核酸酶M2PCSK9显著减少了脱靶效应，尤其是在3’端区域表现出更高的特异性。
免疫毒性评估
所有猴子均出现了短暂的转氨酶升高，这可能与T细胞对载体产物的反应有关。然而，病理学检查显示肝损伤轻微，且未观察到严重不良反应。
结论与意义
该研究表明，通过AAV8载体递送工程化大核酸酶可以在非人灵长类动物肝脏中实现高效且持久的PCSK9基因编辑。这种编辑效果显著降低了PCSK9和LDL水平，为治疗高胆固醇血症提供了新的可能性。此外，第二代大核酸酶M2PCSK9的成功开发展示了优化脱靶效应的潜力。
亮点与创新性
1. 高效且持久的基因组编辑：研究首次在非人灵长类动物中实现了PCSK9的剂量依赖性编辑，并证明了其长期稳定性。
2. 脱靶效应的优化：通过GUIDE-Seq和深度测序技术，研究团队成功开发了第二代大核酸酶M2PCSK9，显著减少了脱靶效应。
3. 免疫毒性评估：研究系统评估了体内基因组编辑的免疫毒性，为未来临床试验提供了重要参考。
其他有价值的内容
研究还探讨了AAV载体在肝脏中的动态变化，发现载体DNA和表达水平在注射后迅速下降，但基因组编辑效果保持稳定。这一现象可能与肝脏细胞的特殊生物学特性有关，值得进一步研究。