学术研究报告：重复经颅磁刺激（rTMS）促进缺血性卒中大鼠神经功能恢复及小胶质细胞抗炎极化的机制研究

一、研究团队与发表信息

本研究由中山大学附属第三医院康复医学科的Jing Luo、Yuan Feng、Mingyue Li、Mingyu Yin，以及神经外科的Feng Qin和Xiquan Hu共同完成，发表于Frontiers in Cellular Neuroscience期刊（2022年4月12日，DOI: 10.3389/fncel.2022.878345）。

二、学术背景

缺血性卒中（Ischemic Stroke, IS）是导致死亡和残疾的主要神经系统疾病，但现有治疗时间窗有限，约70%-80%的幸存者遗留功能障碍。神经凋亡和坏死是卒中急性期的主要细胞死亡模式，而神经发生（neurogenesis）是功能恢复的关键。重复经颅磁刺激（repetitive Transcranial Magnetic Stimulation, rTMS）作为一种非侵入性脑刺激技术，已证实可促进神经功能恢复，但其机制尚未明确。

小胶质细胞（microglia）是中枢神经系统的主要免疫细胞，在卒中后呈现促炎（M1型）或抗炎（M2型）极化状态，影响神经炎症与修复。既往研究对小胶质细胞在rTMS中的作用存在争议：部分认为rTMS抑制其促炎活性，另一部分则发现rTMS可能诱导促炎表型。本研究旨在阐明rTMS是否通过调控小胶质细胞极化改善神经功能，并探索其分子机制。

三、研究流程与方法

1. 动物模型与分组

• 研究对象：80只雄性自发性高血压大鼠（SHRs），体重200-240 g，随机分为假手术组（Sham）、rTMS未刺激组（TMS−）和rTMS刺激组（TMS+），每组24只，进一步按观察时间点（7天和28天）分为亚组（n=12）。
  
• 卒中模型：通过短暂大脑中动脉闭塞（MCAO）手术诱导缺血性卒中，术后筛选神经功能评分（mNSS 7-12分）的大鼠纳入实验。
  

2. rTMS干预方案

• 参数：10 Hz频率，30%最大输出强度，每日1次，每次1,200个脉冲（11分44秒），持续7天或28天。
  
• 设备：使用MagPro X100磁刺激仪及动物专用八字线圈（MC-B35）。
  

3. 细胞实验

• 小胶质细胞提取与处理：从新生Wistar大鼠脑组织分离原代小胶质细胞，分为LPS激活组（TMS−）和LPS激活后rTMS处理组（TMS+）。
  
• 神经干细胞（NSCs）培养：从胚胎大鼠（E14.5）分离NSCs，分别用两组小胶质细胞的条件培养基（CM）培养，评估其增殖、凋亡及分化。
  

4. 检测指标与方法

• 神经功能评估：
  
  • 改良神经功能缺损评分（mNSS）：评估运动、感觉、平衡和反射功能。
    
  • Morris水迷宫（MWM）和新物体识别（NOR）测试认知功能。
    
• 分子与细胞分析：
  
  • 免疫荧光：检测Brdu+（增殖标记）和DCX+（神经前体细胞标记）细胞。
    
  • Western blot：分析凋亡相关蛋白（cleaved-caspase3）及炎症通路蛋白（p-IκBα、p-NF-κB、p-STAT6）。
    
  • ELISA：定量促炎因子（TNF-α、IL-1β）和抗炎因子（IL-4、IL-10）。
    
  • 流式细胞术：评估小胶质细胞表型（CD86+促炎型、CD206+抗炎型）。
    

5. 数据统计

采用Prism 7.0软件进行t检验或单因素ANOVA分析，显著性阈值设为p < 0.05。

四、主要研究结果

1. 神经功能恢复：

   • 长期（28天）rTMS显著改善大鼠认知功能（NOR识别率提高，MWM逃逸潜伏期缩短）并减少脑梗死体积（MRI验证），而短期（7天）效果有限。
     
   • mNSS评分显示rTMS组神经功能持续改善（p < 0.01）。
     

2. 神经发生与凋亡抑制：

   • rTMS长期治疗增加Brdu+/DCX+神经前体细胞数量（p < 0.05），并降低凋亡细胞（TUNEL+）和cleaved-caspase3表达。
     

3. 炎症调控：

   • rTMS抑制促炎因子（TNF-α、IL-1β）的mRNA和蛋白表达，同时提升抗炎因子（IL-4、IL-10）水平。
     
   • Western blot显示rTMS下调NF-κB和STAT6磷酸化，提示其通过抑制炎症通路发挥作用。
     

4. 小胶质细胞极化：

   • 体内实验：rTMS增加CD206+抗炎型小胶质细胞比例（p < 0.05），但对CD86+促炎型无显著影响。
     
   • 体外实验：rTMS处理的LPS激活小胶质细胞分泌更多IL-4和IL-10，且其条件培养基（TMS+-CM）促进NSCs向神经元分化（Tubb3表达上调）。
     

五、研究结论与价值

本研究首次系统阐明rTMS通过促进小胶质细胞向抗炎表型极化，改善缺血性卒中后的神经功能恢复。其机制包括：
1. 抗炎作用：抑制NF-κB/STAT6通路，减少促炎因子释放。
2. 神经保护：增强神经发生并抑制凋亡。
3. 转化意义：为优化rTMS治疗参数（如频率、疗程）提供实验依据，推动其在卒中康复中的临床应用。

六、研究亮点

1. 创新性发现：揭示rTMS调控小胶质细胞极化的独立性作用，而非仅抑制促炎表型。
   
2. 方法学优势：结合体内外模型，明确小胶质细胞CM对NSCs分化的影响。
   
3. 临床启示：长期rTMS治疗（28天）效果优于短期，提示疗程设计的重要性。
   

七、其他价值

研究还发现rTMS可能通过间接途径（如激活星形胶质细胞）调控炎症微环境，未来可进一步探索多细胞交互机制。