一项关于新型RANKL变体作为疫苗和抑制剂预防骨质疏松症的综合研究报道

本报道旨在介绍一项近期发表于学术期刊 Clinical and Translational Medicine 的研究。该研究由韩国全北国立大学医院骨科研究实验室、基础科学研究院、全南国立大学医学院生物医学科学系以及全北大学医学院生理学系的Young Jong Ko, Hong Moon Sohn, Yuria Jang, Mineon Park, Bora Kim, Beomchang Kim, Jae-Il Park, Hoon Hyun, Byeongseok Jeong, Chansik Hong 和 Wonbong Lim 等学者共同完成。研究论文于2021年3月15日在线发表（DOI: 10.1002/ctm2.368），题为“一种新型修饰的RANKL变体可作为疫苗和抑制剂来预防骨质疏松”。

研究背景与目标

本项研究属于骨代谢与骨质疏松症治疗领域。骨质疏松症是一种系统性骨骼疾病，其特征是骨量减少、骨微结构破坏和骨骼脆性增加，导致骨折风险显著升高。骨稳态的维持依赖于成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收之间的动态平衡。其中，核因子κB受体活化因子配体（Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand， RANKL）是调控破骨细胞分化与活化的关键因子。当RANKL与其受体RANK结合时，会启动下游信号通路，促进破骨细胞前体分化成为成熟的、具有骨吸收功能的多核破骨细胞。

尽管目前已有针对RANKL的单克隆抗体（如Denosumab）用于临床治疗骨质疏松症，但其成本高昂且需长期注射给药，患者依从性面临挑战。因此，开发一种高效、成本低廉且可能提供长期保护作用的替代疗法具有重要价值。研究者设想，能否通过疫苗接种策略，诱导机体自身产生针对RANKL的抗体，从而长期抑制破骨细胞活性。然而，直接使用野生型RANKL作为疫苗存在风险，因为其本身可能激活RANK信号通路，反而短暂促进骨吸收。此外，RANKL在免疫系统中也扮演角色，可能引发不必要的免疫反应。

因此，本研究的目标是设计并评估一种经过修饰的RANKL变体。该变体需满足两个关键条件：第一，它自身不能与RANK受体结合从而激活破骨细胞分化；第二，它必须能作为有效的免疫原，诱导产生高滴度的、能中和内源性RANKL的抗体。研究者进一步关注到，RANKL还存在另一个受体——富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4（Leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 4， LGR4）。LGR4与RANK竞争结合RANKL，并通过负反馈机制抑制破骨细胞活性。研究者假设，设计的RANKL变体若能特异性激活LGR4信号通路（而非RANK通路），则可能在发挥疫苗作用的同时，本身也能作为一种竞争性抑制剂，对破骨细胞生成产生直接抑制效果。

详细研究方法与流程

本研究流程复杂而系统，主要分为三个核心阶段：RANKL变体的设计、筛选与体外功能验证；在卵巢切除（Ovariectomized， OVX）诱导的骨质疏松小鼠模型中评估其预防效果；以及在可溶性RANKL诱导的小鼠模型中评估其抗体的治疗作用。

第一阶段：变体设计与体外验证。 研究者以小鼠RANKL为模板，选取了与RANK结合密切相关的五个保守氨基酸位点（K180, D189, R190, H223, H224）。通过定点突变技术，他们构建了四个候选变体（mRANKL-MT1至MT4），特别是MT3（H223F, H224Y）和MT4（H223Y, H224F）。所有变体均在*E. coli*中表达并纯化得到GST融合蛋白。随后，利用从小鼠骨髓中分离的破骨细胞前体细胞（骨髓源性单核/巨噬细胞， Bone Marrow-derived Monocytes， BMMs）进行了一系列体外实验。 1. 破骨细胞分化抑制实验：使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色评估各变体单独或与野生型RANKL共处理时，对破骨细胞形成的抑制能力。结果显示，所有变体自身均不诱导破骨细胞形成，其中mRANKL-MT3在与野生型RANKL竞争时抑制效果最强。 2. 骨吸收与细胞骨架分析：通过骨吸收陷窝分析（Osteo Assay plate）和F-actin环染色，证实mRANKL-MT3能有效抑制破骨细胞的骨吸收活性及其特征性的肌动蛋白环结构形成。 3. 分子机制探究： * 受体结合特性：通过免疫共沉淀和流式细胞术分析，证实mRANKL-MT3不与RANK结合，但能与LGR4结合。而野生型RANKL可同时与两者结合。 * 信号通路分析：蛋白质印迹分析显示，野生型RANKL能强烈激活MAPK、Akt、NF-κB p65、Src和GSK-3β的磷酸化。而mRANKL-MT3仅显著激活GSK-3β（与LGR4下游信号相关），对其他通路的激活作用很弱，尤其是与RANK信号密切相关的Src。 * 钙信号与核转位：钙成像实验表明，mRANKL-MT3诱导的细胞内钙离子浓度升高远低于野生型RANKL。同时，免疫荧光和核质分离蛋白印迹显示，mRANKL-MT3处理不能诱导破骨细胞关键转录因子NFATc1从细胞质向细胞核转位。 * 基因表达分析：实时定量PCR证实，mRANKL-MT3处理下调了与破骨细胞分化相关的基因（如Trap, Oscar, Nfatc1, Cathepsin K, *Dc-stamp*）的表达。

第二阶段：在OVX骨质疏松模型中的预防效果评估。 将50只雌性C57BL/6小鼠分为5组：假手术组（Sham）、OVX模型组、仅免疫组（非OVX）、OVX+阿仑膦酸钠治疗组（阳性对照）以及OVX+mRANKL-MT3免疫组。免疫组小鼠间隔2周，共接受3次mRANKL-MT3与佐剂的腹腔注射。12周后处死小鼠进行分析。 1. 骨微结构分析：使用微型计算机断层扫描对股骨远端进行成像。定量分析显示，与OVX组相比，MT3免疫组小鼠的骨矿物质密度、骨体积分数和骨小梁数量均显著提高，骨微结构得到有效保护，效果与阿仑膦酸钠组相当，且未对非OVX小鼠产生不良影响。 2. 血清学分析：酶联免疫吸附测定检测显示，MT3免疫组小鼠血清中产生了高滴度的抗RANKL特异性IgG抗体。这些抗体滴度与血清中骨吸收标志物CTX-1和可溶性RANKL的水平呈负相关，与骨密度呈正相关。 3. 组织学分析：股骨组织切片进行H&E染色、TRAP染色和Cathepsin K免疫组化。结果显示，MT3免疫组小鼠股骨中的破骨细胞数量和活性显著低于OVX组，骨小梁结构更为完整致密。 4. 免疫反应评估：分离小鼠脾淋巴细胞，经RANKL或MT3刺激后，检测细胞因子。发现免疫后小鼠脾细胞主要产生Th2型细胞因子（IL-4, IL-10），而Th1型细胞因子IFN-γ无显著变化，提示免疫反应偏向于辅助B细胞产生抗体的类型，可能更安全。

第三阶段：抗体的分离及其在RANKL诱导模型中的治疗作用评估。 为了直接证明免疫产生的抗体具有治疗效果，研究者从MT3免疫小鼠血清中纯化出抗RANKL IgG。 1. 体内治疗实验：建立可溶性RANKL（sRANKL）诱导的小鼠骨质疏松模型，并分为三组：对照组、sRANKL+对照IgG组、sRANKL+抗RANKL IgG组。通过micro-CT和组织学分析发现，注射纯化的抗RANKL IgG能显著改善sRANKL引起的骨丢失，减少破骨细胞数量，降低血清CTX-1和sRANKL水平。 2. 体外验证抗体功能：在BMMs培养体系中，加入纯化的抗RANKL IgG，能剂量依赖性地抑制sRANKL诱导的破骨细胞形成、骨吸收陷窝形成，并下调破骨细胞相关基因表达。机制研究表明，抗RANKL IgG能够阻断sRANKL诱导的MAPK、Akt、Src和GSK-3β信号通路的激活，抑制NFATc1核转位和钙离子内流。

主要研究结果与结论

本研究获得了一系列相互支持、逻辑严谨的结果。首先，通过精巧的分子设计，成功获得了mRANKL-MT3这一关键变体，它在体外被证明能结合LGR4并激活其下游的GSK-3β信号，但不激活RANK信号，自身无促破骨细胞生成活性，并能有效竞争性抑制野生型RANKL的功能。这一结果为后续的疫苗策略奠定了安全性和有效性的双重基础。

其次，动物实验有力证实了mRANKL-MT3作为一种“治疗性疫苗”的双重作用机制。第一重作用（抑制剂作用）：mRANKL-MT3本身作为LGR4的配体，通过激活GSK-3β等信号，形成负反馈调控，直接抑制RANKL-RANK-NFATc1信号轴，从而在初始阶段就控制破骨细胞活性。第二重作用（疫苗作用）：mRANKL-MT3作为免疫原，成功打破了机体对自身RANKL的免疫耐受，诱导产生了高效价的、具有中和能力的多克隆抗体。这些抗体能持续清除或阻断内源性（如OVX后升高的）或外源性（注射的）RANKL，长期保护骨骼。血清学和组织学数据（抗体滴度与骨密度正相关，与骨吸收标志物负相关）清晰地揭示了这种因果关系。最后，从免疫小鼠血清中直接分离出的抗RANKL IgG在独立的疾病模型中展现出显著的治疗效果，从另一个角度确证了抗体介导的保护作用是有效的。

因此，本研究得出结论：通过最小化氨基酸替换构建的RANKL变体mRANKL-MT3，能够作为一种新型的“双重功能制剂”，既可作为LGR4信号通路的激动剂发挥竞争性抑制作用，又可作为免疫原诱导产生保护性抗体，从而有效预防OVX和sRANKL诱导的骨质疏松症。 这为骨质疏松症的预防和治疗提供了一种创新的免疫治疗策略。

研究价值与亮点

本研究的科学价值和应用潜力突出。在科学上，它深化了对RANKL-LGR4轴在骨代谢中负反馈调控作用的理解，并巧妙地将这一基础生物学知识转化为治疗策略。研究证实，通过精细的蛋白质工程改造，可以分离RANKL对其两个受体的功能，这为设计其他具有特定受体偏向性的细胞因子变体提供了思路。

在应用上，本研究提出的疫苗策略具有潜在优势：1) 长效性：一次免疫（可能需加强针）有望产生长期保护，克服了单抗需要频繁注射的缺点。2) 成本效益：相较于生产复杂的单克隆抗体，重组蛋白疫苗的生产成本可能更低。3) 安全性探索：研究初步表明免疫反应偏向Th2型，且未在正常小鼠中观察到明显副作用，为后续安全性评估奠定了基础。文中也讨论了该策略可能避免停用Denosumab后出现的快速骨转换反弹风险的潜在优势。

本研究的亮点在于：研究设计的创新性：将“竞争性受体激动”和“主动免疫”两种机制融合于一个分子实体中，构思巧妙。证据链条的完整性：从分子机制（结合、信号）、到细胞功能（分化、吸收）、再到动物模型（预防、治疗），以及最终的抗体分离验证，构成了一个非常完整和令人信服的证据体系。方法的严谨性：使用了多种互补的技术手段（如co-IP、FACS、钙成像、micro-CT、组织形态计量学等）对假设进行多角度验证。

其他要点与展望

研究者也客观指出了本研究的局限性。主要在于：1) 所用变体基于小鼠RANKL，与人类序列存在差异，其临床转化需进一步构建人源化RANKL变体并在人源化小鼠模型中进行测试。2) LGR4信号也被报道能刺激成骨细胞分化，本研究未深入探讨mRANKL-MT3对成骨细胞的潜在影响。3) 变体仍保留了与骨保护素结合的能力，后者是体内天然的RANKL抑制剂，未来或需进一步优化以规避其干扰。4) RANKL在免疫系统中的作用意味着长期疫苗安全性需在更接近人类的模型中进行更全面评估。

尽管如此，这项研究无疑为骨质疏松症的免疫治疗开辟了一条富有前景的新途径。它不仅仅是一个简单的疫苗研究，更展示了一种基于对疾病分子机制深入理解而进行“智能药物设计”的范例。未来的研究将聚焦于解决上述局限性，推动这一策略向临床应用迈进。