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一、研究作者、机构与发表信息
本研究的通讯作者为方成（Fang Cheng）与王连辉（Lianhui Wang），其所在机构为南京邮电大学有机电子与信息显示国家重点实验室及江苏省生物传感器重点实验室、先进材料研究所。论文第一作者为 Wentao Xiao、Kuiming Qu、Wei Zhang、Lunhui Lai、Lei He。该研究于2024年发表于 Small Science 期刊，论文DOI为10.1002/smsc.202300164，并于2023年8月22日投稿、2023年11月11日修回、2024年1月17日在线发表。
二、研究背景与目的
结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是第二大致命性恶性肿瘤，约50%的患者会发生转移。免疫治疗虽然具有对抗转移的潜力，但大多数结直肠癌患者因肿瘤属于“冷肿瘤”而反应不佳。诱导免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death, ICD）是提高免疫治疗敏感性的有效策略。ICD通过释放钙网蛋白（calreticulin, CRT）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）和三磷酸腺苷（ATP）等损伤相关分子模式（danger associated molecular patterns, DAMPs）来激活适应性免疫系统，将“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”。然而，传统ICD多依赖细胞凋亡，而肿瘤对凋亡的固有抗性限制了疗效。
铜死亡（cuproptosis）是一种新型程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD）方式，其机制为铜过载引起线粒体脂酰化蛋白聚集和铁硫簇蛋白失稳。由于机制与凋亡完全不同，铜死亡能有效规避凋亡抗性。但铜死亡介导的免疫激活效率仍不理想。焦亡（pyroptosis）是一种促炎性细胞死亡方式，由gasdermin（GSDM）蛋白介导的膜穿孔和细胞肿胀为特征，可快速释放DAMPs并诱导ICD。特别是gasdermin E（GSDME）在结直肠癌（尤其是CT26细胞系）中高表达，可被caspase-3切割后触发焦亡。因此，将铜死亡与焦亡协同诱导，是增强铜死亡免疫原性的理想策略。
研究还面临靶向性问题：铜死亡和焦亡治疗可能损伤正常细胞。肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中谷胱甘肽（glutathione, GSH）高表达，可作为肿瘤靶向的响应开关；同时，结直肠癌中硫化氢（H₂S）过表达，H₂S可与铜离子反应原位生成硫化铜，用于光热治疗（photothermal therapy, PTT）和化学动力学治疗（chemodynamic therapy, CDT）。本研究旨在构建GSH和H₂S双响应性纳米材料，协同诱导结直肠癌特异性铜死亡和焦亡，实现高效肿瘤靶向免疫治疗。
三、研究流程与实验方法
研究首先合成了MOF-199纳米颗粒（metal–organic framework nanoparticles）。MOF-199由苯-1,3,5-三甲酸三乙铵盐与硝酸铜在乙醇和去离子水混合溶剂中反应制备，随后用Pluronic F127进行表面修饰，得到F127MOF-199纳米颗粒（NPs），以提升体内稳定性和生物相容性。透射电子显微镜（TEM）显示纳米颗粒平均尺寸约为107.8 nm，X射线衍射（XRD）证实修饰后仍保持高结晶度，X射线光电子能谱（XPS）确认铜以Cu²⁺形式存在，比表面积高达1688.8 m² g⁻¹，孔径为0.8–1.2 nm。红细胞溶血实验证明纳米颗粒具有良好的生物相容性。
随后研究评估了F127MOF-199 NPs对GSH和H₂S的双响应性。在10 mM GSH处理下，纳米颗粒在10分钟内开始降解，3小时内完全解离，释放Cu²⁺的比例最高达67.1%。通过5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）探针证实了纳米颗粒具有浓度依赖性的GSH消耗能力。在H₂S响应方面，以NaHS模拟内源性H₂S，溶液颜色由蓝色变为棕黑色，近红外二区（NIR-II）吸收逐渐增强，表明生成了硫化铜。TEM显示产物尺寸减小至16.2 nm，元素分布图显示Cu和S均匀分布，XPS证实产物为Cu₂₋ₓS，其中Cu⁺约占70%、Cu²⁺约占30%。
在光热与化学动力学性能方面，生成的Cu₂₋ₓS NPs在1064 nm激光照射下表现出优异的光热转换能力，光热转换效率为43.6%。通过TMB（3,3,5,5-四甲基联苯胺）显色法、对苯二甲酸（TPA）荧光法和电子自旋共振（ESR）实验，证明了Cu₂₋ₓS NPs可催化H₂O₂产生羟基自由基（•OH），且激光照射可增强活性氧（reactive oxygen species, ROS）的生成，即光热增强的化学动力学效应。
体外治疗实验中，以CT26结肠癌细胞为肿瘤细胞模型，以L02和3T3细胞为正常细胞模型。CCK-8实验显示，F127MOF-199 NPs在暗条件下即对CT26细胞具有明显毒性，1064 nm激光照射后毒性进一步增加；而对正常细胞的毒性在200 μg mL⁻¹浓度下仍可忽略。细胞内GSH和H₂S含量检测证实纳米颗粒能在细胞内消耗这两种物质。ROS探针DCFH-DA显示处理组荧光增强，线粒体染色和细胞色素c免疫荧光显示线粒体受损及细胞色素c释放。
在细胞死亡机制验证中，倒置显微镜观察到处理组细胞出现肿胀和气球样变，表明发生焦亡。caspase-3活性在F127MOF-199+激光组比对照组增加10.7倍，Western blot显示GSDME全长（GSDME-FL）明显减少，细胞内ATP水平升高，IL-1β和IL-18释放分别增加5.6倍和6.1倍，均证实焦亡发生。铜死亡方面，免疫荧光显示DLAT聚集灶，Western blot显示FDX1和LIAS蛋白水平降低，且加入铜死亡抑制剂鱼藤酮后细胞活性显著恢复，证明铜死亡在细胞死亡中起重要作用。
ICD与免疫激活实验显示，F127MOF-199+激光组CRT暴露增加4.1倍，HMGB1释放增加8.2倍。骨髓来源树突状细胞（BMDCs）成熟实验显示，F127MOF-199+激光组成熟DC比例达到20.6%，远高于对照组的9.7%。
体内实验中，使用CT26荷瘤BALB/c小鼠模型。荧光成像显示纳米颗粒在肿瘤部位12小时富集达到峰值，因此选择注射后12小时进行1064 nm激光照射。F127MOF-199+激光组肿瘤温度升至45.4°C。肿瘤生长曲线显示该组肿瘤生长被显著抑制，生存期延长，体重、血液指标和主要器官H&E染色均未显示明显毒性。肿瘤组织免疫组化显示该组DLAT聚集和LIAS丢失最严重，caspase-3切割最明显，GSDME-FL下调最显著。ELISA检测显示IL-1β、IL-18、TNF-α和IFN-γ水平均显著升高。流式细胞术分析显示，肿瘤引流淋巴结中成熟DC比例在F127MOF-199+激光组达38.2%，脾脏中成熟DC比例达44.7%，脾脏CD8⁺ T细胞比例达43.5%，肿瘤切片CD8⁺ T细胞浸润也最高。
四、主要结果与数据支撑
研究结果可归纳为以下几个方面。第一，F127MOF-199 NPs制备成功且具有良好的理化性质：平均粒径107.8 nm，比表面积1688.8 m² g⁻¹，表面修饰后Zeta电位明显降低，在不同生物介质中保持胶体稳定性，溶血活性可忽略。第二，纳米颗粒具有GSH/H₂S双响应性：GSH触发纳米颗粒解离并释放Cu²⁺，3小时释放率达67.1%；H₂S触发原位硫化生成Cu₂₋ₓS NPs，尺寸从107.8 nm减小至16.2 nm，后者在NIR-II区域具有强吸收。第三，Cu₂₋ₓS NPs光热转换效率为43.6%，且可产生ROS，激光照射增强CDT效果。第四，体外实验中纳米颗粒对CT26肿瘤细胞具有选择性毒性，对正常细胞毒性可忽略；机制上同时激活了焦亡（细胞肿胀、caspase-3激活、GSDME-FL降低、IL-1β/IL-18升高）和铜死亡（DLAT聚集、FDX1/LIAS降低、鱼藤酮逆转毒性）。第五，ICD标志物CRT和HMGB1显著上调，BMDCs成熟比例明显提高。第六，体内实验中F127MOF-199+激光组肿瘤生长显著抑制，生存期延长，肿瘤组织中铜死亡和焦亡标志物变化与体外一致，成熟DC和CD8⁺ T细胞比例显著升高，免疫激活效果明确。
五、结论与科学价值
本研究成功制备了GSH/H₂S双响应性F127MOF-199 NPs，用于结直肠癌靶向免疫治疗。纳米颗粒进入肿瘤细胞后，在GSH作用下释放Cu²⁺，进一步转化为毒性更强的Cu⁺，诱导铜过载介导的铜死亡；同时，在H₂S作用下原位硫化生成Cu₂₋ₓS NPs，通过PTT和CDT激活caspase-3，切割GSDME触发焦亡。铜死亡与焦亡协同作用高效诱导ICD，促进DC成熟、CD8⁺ T细胞活化和肿瘤生长抑制，成功将“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”。该研究为基于MOF-199纳米颗粒的肿瘤靶向免疫治疗提供了新策略，展示了铜死亡与焦亡协同增强免疫原性的巨大潜力。
六、研究亮点
本研究的亮点包括：首次发现MOF-199 NPs可协同诱导铜死亡和焦亡；利用GSH和H₂S双响应性实现结直肠癌特异性靶向，避免对正常细胞的损伤；原位硫化生成Cu₂₋ₓS NPs赋予纳米颗粒NIR-II光热和化学动力学治疗能力；通过焦亡弥补铜死亡免疫原性不足的缺陷，高效激活系统性免疫应答。
七、其他有价值内容
研究还指出，GSH作为铜螯合剂可抑制铜死亡，同时降低ROS诱导ICD的免疫原性，因此设计GSH响应性纳米材料不仅能实现肿瘤靶向，还能增强铜死亡介导的免疫原性。H₂S可通过抑制铜外排蛋白ATP7A增强铜死亡敏感性，因此H₂S响应性设计进一步增强了结直肠癌的特异性治疗效果。