这篇发表在《Communications Biology》（2025年）上的文章，由Joshua H. Bourne、Althea R. Suthya、Brooke J. Wanrooy、Jenny L. Wilson、Shu Wen Wen、Cameron R. Bastow、Gang Zheng、Michelle Rank、Michael J. Hickey和Connie H.Y. Wong共同完成，通讯作者为Connie H.Y. Wong（邮箱：connie.wong@monash.edu）。这些研究人员主要来自澳大利亚莫纳什大学临床科学学院医学系炎症疾病中心、莫纳什大学生物医学影像中心以及墨尔本大学生物医学科学学院解剖学与神经科学系。

本研究属于神经科学和神经免疫学领域，聚焦于缺血性中风（ischemic stroke）后的早期神经炎症（neuroinflammation）机制。目前的临床治疗（如溶栓或取栓）主要集中于移除堵塞血管的血栓以恢复血流，但未能有效应对随之而来的神经炎症，而后者会加剧脑损伤，特别是影响缺血核心周边可挽救的“半暗带”（penumbra）区域。此前，针对外周免疫细胞（如中性粒细胞）向脑部浸润的临床试验多次失败，表明我们对中风后神经炎症的启动机制理解不足。过去的大量研究关注于中风后数天至数周的炎症细胞和细胞因子谱，但作者提出，在这些时间点进行干预为时已晚，无法有效限制脑损伤。因此，本研究旨在探究中风超急性期（hyperacute phase，3小时）和急性期（acute phase，24小时）脑内免疫细胞组成、细胞因子水平及神经功能障碍的变化，以期找到驱动早期神经炎症的关键细胞，为在临床相关时间窗内（如溶栓治疗窗口期）进行干预提供新靶点。其核心目标是明确脑内早期炎症细胞因子的来源，以及脑内常驻免疫细胞（小胶质细胞， microglia）与脑浸润外周免疫细胞（中性粒细胞、单核细胞等）在其中的相对贡献。

本研究的工作流程详尽，涉及多个相互关联的实验步骤。 首先，研究团队建立并验证了小鼠光化学血栓中风（photothrombotic stroke， PT stroke）模型。该模型通过腹腔注射光敏剂玫瑰红（rose bengal），然后用532nm冷激光照射小鼠感觉运动皮层特定区域15分钟，诱导形成大小一致、类似腔隙性梗死（lacunar-like infarct）的局灶性缺血损伤。对照组（sham）小鼠接受相同处理但不进行激光照射。实验使用了7-10周龄的成年雄性小鼠，品系包括野生型C57BL/6J、CX3CR1GFP/+（用于标记小胶质细胞和部分单核细胞）、CatchupIVM-Red（中性粒细胞报告基因小鼠）以及CCR2缺陷型（CCR2RFP/RFP）小鼠。所有动物实验均获得伦理批准。模型验证方面，研究人员通过硫堇（thionin）染色量化了中风后3小时和24小时的梗死体积（样本量：sham n=7， 3小时 n=7， 24小时 n=6），发现梗死体积在24小时内扩大了5倍。同时，他们评估了脑血管完整性，通过静脉注射伊文思蓝（Evans Blue）或70 kDa的右旋糖酐-罗丹明B（dextran–rhodamine B），发现中风后30分钟就出现血管渗漏，并在3小时内持续发展。此外，磁共振成像（MRI）和脑组织湿重测量（样本量n=9-10）也证实了24小时后脑水肿的存在。在神经功能评估上，采用了胶带移除测试（adhesive tape removal test，评估感觉运动功能，样本量sham n=7， PT n=9）和钢丝悬挂测试（wire hang test，评估肌肉/运动功能，样本量n=10），结果显示，中风后3小时和24小时，小鼠的运动功能出现严重损害（悬挂时间分别减少73.8%和81.5%），但感觉运动功能（胶带移除时间）在24小时未受影响。 其次，研究团队系统分析了中风后脑内炎症细胞因子谱和免疫细胞浸润情况。在中风后3小时和24小时，取小鼠脑组织，经心脏灌洗去除血管内血液后，将脑组织分离为对侧（contralateral， CL）、同侧（ipsilateral， IL）、梗死核心（infarct core）及梗死周边（peri-infarct）区域。一部分组织制成匀浆，使用LegendPlex多因子检测试剂盒（mouse inflammation panel）定量分析了20余种细胞因子的浓度（样本量：sham n=10， 3小时 PT n=9， 24小时 PT n=10）。另一部分脑组织经机械和酶解消化后，通过流式细胞术（spectral flow cytometry）分析了脑内的免疫细胞组成。他们建立了详细的门控策略以区分存活的中性粒细胞（CD45hiCD11b+Ly6G+）、单核细胞（CD45hiCD11b+Ly6G-Ly6C+F4/80lo）、单核来源的巨噬细胞（monocyte-derived macrophages， Mono-Macs； CD45hiCD11b+Ly6G-Ly6C+F4/80mid）和小胶质细胞（CD45midCD11b+Ly6G-Ly6C-F4/80hi）（样本量：sham n=4， PT n=6）。此外，还利用CatchupIVM-Red小鼠进行免疫荧光染色，在组织切片中直接观察中性粒细胞的浸润情况。 第三，为了探究外周髓系细胞在早期神经炎症中的作用，研究实施了两种干预策略。一是抗体清除法：在小鼠中风前24小时和1小时，腹腔注射抗Ly6C/Ly6G抗体（克隆RB6-8C5）或其同型对照IgG2b，以清除外周的中性粒细胞和单核细胞（样本量：IgG n=6， 抗Ly6C/G n=8）。通过流式细胞术和外周血分析确认了清除效率（中性粒细胞清除99.9%，单核细胞清除79.1%）。随后，在这些小鼠中风24小时后，检测其脑内细胞因子水平和运动功能。二是基因缺陷模型法：使用CCR2缺陷（CCR2-/-）小鼠，该小鼠由于缺乏功能性CCR2，单核细胞向炎症部位的募集严重受损（样本量：野生型 n=6， CCR2-/- n=8）。同样，在中风24小时后，分析其脑内免疫细胞浸润、细胞因子谱和运动功能。 第四，研究重点关注了小胶质细胞在中风早期的动态变化。利用CX3CR1GFP/+小鼠，他们结合了离体组织双光子显微镜和活体（in vivo）双光子显微成像技术。对于离体分析，取中风后3小时和24小时的小鼠脑组织切片，进行免疫荧光染色（标记血管基底膜层粘连蛋白和血小板GP1bβ），然后使用Olympus FVMPE-RS多光子显微镜获取高分辨率三维图像（样本量n=5只小鼠，每区域分析约500个细胞）。图像数据使用Imaris软件进行三维重建和形态学定量分析，包括小胶质细胞数量、胞体体积、胞体球形度、树突数量及树突分支复杂度。对于活体成像，在中风后3小时和24小时，对麻醉状态下的CX3CR1GFP/+小鼠进行颅骨开窗减薄，在同一区域进行双光子显微成像，实时观察小胶质细胞的形态动态变化（n=3只小鼠/条件）。 第五，为了直接确定超急性期脑内炎症细胞因子的细胞来源，研究团队采用了一种离体培养结合胞内因子染色的方法。将中风后3小时的小鼠脑组织分离成单细胞悬液，在含有蛋白质转运抑制剂（GolgiPlug， brefeldin A）的培养基中培养3小时，以“捕获”并累积细胞新合成的细胞因子。之后，通过流式细胞术同时检测细胞表面标志物和胞内细胞因子（IL-1α， IL-1β， IL-6， TNF-α）。通过组合标志物，他们区分了小胶质细胞（CD45midCX3CR1+）、星形胶质细胞（CD45loGLAST-1+）、内皮细胞（CD45loGLAST-1-CD31+）、周细胞（CD45loGLAST-1-PDGFRβ+）和神经元（CD45loGLAST-1-NeuN+）（样本量n=6），并比较了它们在梗死核心区域与对侧区域细胞因子产生的差异。 数据统计分析均使用GraphPad Prism 10软件进行。数据正态性采用Shapiro-Wilk检验，多组比较使用单因素方差分析（one-way ANOVA）或Kruskal-Wallis检验，两组比较使用非配对t检验或Mann-Whitney检验。使用Grubbs检验排除异常值。所有数据均以平均值±标准差表示，显著性水平设定为*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001。

研究的主要结果层层递进，逻辑严密。 第一阶段的模型与表型分析结果证实，PT中风模型能可靠地引起早期脑血管完整性破坏、进行性发展的脑梗死、脑水肿以及显著的运动功能障碍。这为后续研究神经炎症提供了可靠的病理生理背景。 第二阶段关于细胞因子和免疫细胞浸润的分析得出了关键发现：在中风后超急性期（3小时），梗死核心区域的促炎细胞因子IL-1α、IL-1β和TNF-α的水平就已显著升高，而IL-6在24小时急剧升高。重要的是，这些细胞因子的升高显著早于外周免疫细胞的大量脑浸润。流式细胞术数据显示，中风后3小时，脑内中性粒细胞、单核细胞和单核来源巨噬细胞的数量仅有轻微增加；而到24小时，它们的数量才分别增加了10倍、5倍和8倍。小胶质细胞的数量在整个过程中没有变化。这一结果直接挑战了“外周免疫细胞浸润是中风后神经炎症的起始驱动因素”的传统观点，提示可能存在更早的、脑内起源的炎症信号。 第三阶段的干预实验进一步支持了这一观点。尽管使用抗Ly6C/Ly6G抗体有效清除了外周髓系细胞，但这并未能减弱中风24小时后脑内IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α的升高水平，也未能改善小鼠的运动功能。同样，在CCR2缺陷小鼠中，虽然单核细胞/巨噬细胞的脑浸润被完全阻断，但脑内细胞因子谱与野生型小鼠相比并无差异，运动功能也未见改善。这些结果强有力地证明，在缺血性中风后的最初24小时内，脑浸润的外周髓系细胞（中性粒细胞和CCR2+单核细胞/巨噬细胞）并非神经炎症和神经功能缺损的必要贡献者。 第四阶段对小胶质细胞的研究揭示了其在中风早期的剧烈反应。形态学分析显示，早在中风后3小时，梗死核心区域的小胶质细胞就出现了数量减少、胞体体积增大、球形度增加、树突数量和复杂度显著降低的“去分枝化”（de-ramification）激活形态。这些变化在24小时后更为明显，并扩展至梗死周边区域。活体双光子显微镜实时观测到了相同的变化过程，显示小胶质细胞树突快速回缩，胞体出现“气泡状”膨大。这些形态学的快速改变提示小胶质细胞在中风后极早期就已进入高度活跃的应答状态。 第五阶段的细胞来源分析最终锁定了早期炎症因子的主要生产者。离体培养和胞内染色结果显示，在中风后3小时，神经元和小胶质细胞是促炎细胞因子的主要生产者。与对侧组织相比，梗死核心区域的神经元产生的IL-1β、IL-6和TNF-α分别增加了34%、20%和31%；而小胶质细胞的增加幅度更为显著，分别达到50%、44%和30%。IL-1α在两者中均下降，研究者认为这可能是因为IL-1α作为一种预存的“警报素”（alarmin），已在组织损伤时快速释放。相比之下，星形胶质细胞、内皮细胞和周细胞的细胞因子产生变化不大。结合之前发现的“3小时时外周免疫细胞浸润极少”这一事实，该结果明确证实，小胶质细胞是缺血性中风超急性期脑内关键促炎细胞因子（IL-1β， IL-6， TNF-α）的最主要生产者。

本研究得出的核心结论是：在缺血性中风的超急性期，脑内常驻免疫细胞——小胶质细胞，而非脑浸润的外周髓系细胞，是早期神经炎症的关键驱动者。小胶质细胞在中风发生后数小时内即发生剧烈的形态学重组，并迅速上调促炎细胞因子的产生，从而启动了神经炎症反应。这一发现解释了为何之前针对外周免疫细胞募集的临床试验会失败——因为当这些细胞到达脑部时，炎症已经由小胶质细胞启动。因此，研究认为，在临床相关的时间窗（如溶栓治疗的3-4.5小时内）内，调控小胶质细胞的功能，而非阻止外周细胞浸润，可能是减轻脑损伤、改善中风预后的更有前景的治疗策略。

本研究的科学价值和应用意义重大。在科学上，它颠覆了对于中风后神经炎症启动机制的固有认知，将关注焦点从外周免疫系统转移到了脑内常驻免疫系统，强调了中枢神经系统自身免疫反应在急性损伤中的首要作用。这为理解中风病理生理的早期事件提供了全新的视角。在应用上，该研究为开发新的神经保护疗法指明了方向。靶向小胶质细胞的特异性通路（如嘌呤能信号、炎症小体激活等），有望在现有血管再通治疗的基础上，增加抗炎神经保护维度，从而更有效地挽救缺血半暗带，减少后遗症。同时，研究结果也警示，未来治疗策略需要更精细的时间窗口考量，干预必须足够早才能有效。

本研究的亮点突出。首先，在发现上具有重要突破：首次系统证实了外周髓系细胞并非中风超急性期神经炎症的必需启动者，而小胶质细胞是早期关键炎症因子的主要来源。其次，在研究方法上具有高度的系统性和先进性：研究结合了严谨的时空分析（超急性期3小时 vs 急性期24小时）、多角度的干预手段（抗体清除与基因缺陷）、先进的活体与离体成像技术（双光子显微镜实时观测小胶质细胞形态动力学）以及精确的细胞来源解析技术（离体培养结合多色流式胞内因子检测）。这种多技术联用的策略为结论提供了强有力的、相互印证的多重证据。特别是活体成像技术，直观地展示了小胶质细胞在活体脑中随时间的动态变化，是本研究的一大特色。再者，研究设计与临床问题紧密结合，所关注的超急性期时间点与临床溶栓治疗窗口高度一致，极大地提升了其转化医学意义。

此外，研究还包含其他有价值的讨论。作者指出，小胶质细胞的功能高度依赖于损伤的原因、部位和时机。他们讨论了不同中风模型（如永久性大脑中动脉阻塞模型MCAO与PT模型）可能因损伤严重程度不同而导致小胶质细胞功能差异，这提示未来研究需考虑损伤异质性的影响。同时，研究观察到小胶质细胞的早期形态和分泌功能变化，并未伴随经典激活标记物（如CD80， MHC-II， CD206）的显著改变，这凸显了传统M1/M2二分法在描述小胶质细胞早期活化状态时的局限性，支持了该领域关于小胶质细胞存在更复杂、更动态功能状态的新观点。最后，作者也坦承了研究的局限性，例如目前缺乏特异性清除小胶质细胞而不影响其他巨噬细胞的技术，以及CX3CR1报告基因也在部分单核细胞亚群中表达等，并对未来利用单细胞组学（single cell ‘omics’）等技术进一步解析小胶质细胞异质性、开发靶向小胶质细胞的精准纳米药物等方向进行了展望。这些讨论使研究的深度和广度得到进一步拓展。