本研究由Joel W. Blanchard和Michael Bula等人领衔，通讯作者为Li-Huei Tsai。主要研究人员来自麻省理工学院Picower学习与记忆研究所、大脑与认知科学系、计算机科学与人工智能实验室，以及哈佛大学和麻省理工学院Broad研究所，合作单位还包括拉什大学阿尔茨海默病中心。该研究发表于《自然·医学》（*Nat Med.*）期刊，最终修订版于2020年6月出版（卷26，期6，页952-963）。
本研究属于神经科学与生物医学工程交叉领域，聚焦于阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）的发病机制研究，具体针对脑淀粉样血管病（Cerebral Amyloid Angiopathy, CAA）。APOE4基因型是散发性AD和CAA最强的遗传风险因素，但其导致脑血管病变的具体分子与细胞机制尚不明确。由于缺乏可操作的人类血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）体外模型，这一研究长期以来面临挑战。因此，本研究旨在构建一个能够概括人体BBB解剖与生理特性的体外三维模型，并利用此模型揭示APOE4基因型如何通过特定细胞类型（如周细胞）导致CAA病理的分子机制，从而为开发针对性的治疗策略提供新靶点。
研究的工作流程系统而严谨，主要包括以下几个核心部分：
第一部分：体外三维人类诱导多能干细胞来源血脑屏障（iBBB）模型的构建与验证。 研究团队首先优化了从人类诱导多能干细胞（iPSC）分化为三种构成BBB的关键细胞类型的方法：脑内皮细胞（BECs）、具有周细胞样特性的壁细胞（iMCs）和星形胶质细胞。为了精确鉴定iMCs的身份（周细胞缺乏特异性标志物），研究人员进行了RNA测序，并将其转录组与已发表的人体内周细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的数据集进行比较。结果显示，iMCs高表达周细胞标志基因（如LAMA2, PDGFRB），而不表达间充质相关基因，且通过无监督层次聚类分析，iMCs与人脑海马单细胞核RNA测序数据中的“体内周细胞”簇表现出更高的转录相似性。随后，将这三种细胞以三维形式包埋于基质胶中，在特定生长因子（PDGF-BB, VEGFA）作用下共培养两周。细胞自组装形成了由CD144阳性内皮细胞构成的、相互连接的大规模毛细血管样网络。iMCs在培养过程中从均匀分布转变为聚集并包绕在内皮血管周围，表达SM22和NG2等标志物。星形胶质细胞则延伸出GFAP阳性的突起包围血管，并在与内皮细胞接触的部位表达极性分布的水通道蛋白4（AQP4），模拟了体内星形胶质细胞终足的结构与功能。重要的是，培养一个月后，模型自身产生了在基质胶中原本不存在的层粘连蛋白α4（LAMA4），表明其具有重塑细胞外基质、形成类似体内基底膜结构的能力。转录分析（qRT-PCR）证实，与单独培养的BECs或BECs与其他细胞类型的共培养相比，完整iBBB模型中BBB相关基因（如CLDN5, JAM-A, P-gp, LRP1, RAGE, GLUT1等）的表达显著上调。在功能验证方面，研究建立了Trans-well系统进行生理特性测试。iBBB模型显示出极高的跨内皮电阻（TEER，平均约8030 Ω·cm²），且变异系数小，表明其屏障完整性好且稳定。不同分子量（0.1至80 kDa）示踪分子的旁细胞渗透性测试显示，iBBB的渗透性显著低于仅由BECs构成的单层。这种渗透性的降低并非简单地叠加细胞层所致，因为单独添加额外iMCs或星形胶质细胞均无效，必须两者同时存在。此外，iBBB模型中的外排泵P-糖蛋白（P-gp）和ABCG2表达上调，并表现出极性分布（主要位于顶膜），功能实验证实其能有效将底物（如罗丹明123）从顶侧泵出至基底侧。这些分子和功能特征证明，构建的iBBB模型成功复现了人体BBB的关键特性。
第二部分：利用iBBB模型研究APOE4对Aβ积累的影响及关键细胞类型的鉴定。 研究团队首先验证了iBBB能否模拟CAA的血管淀粉样蛋白沉积。当使用来自家族性AD（APP基因重复）神经元培养的条件培养基（富含Aβ）处理iBBB时，模型内出现了显著的淀粉样蛋白积累，而对照条件培养基则没有，表明iBBB可模拟体内血管淀粉样病变。接下来，使用同基因的APOE3/3和APOE4/4 iPSCs来源的iBBB进行比较。暴露于Aβ条件培养基后，APOE4/4 iBBB中由多种抗体（6E10， D54D2， 12F4）检测到的淀粉样蛋白积累量，以及硫黄素T（ThT）标记的纤维状淀粉样蛋白，均显著高于APOE3/3 iBBB。使用荧光标记的合成Aβ肽进行实验也得到一致结果，排除了条件培养基中其他因素的干扰。空间分布分析显示，APOE4/4 iBBB中不仅靠近血管的“血管淀粉样蛋白”增多，血管周围实质区的“非血管淀粉样蛋白”也增加，后者常与星形胶质细胞共定位。为确定导致这一表型的关键细胞类型，研究人员设计了一个组合筛选实验，构建了八种可能的不同基因型细胞组合的iBBB（BECs， iMCs， 星形胶质细胞分别来自APOE3/3或APOE4/4）。分析发现，所有表现出低淀粉样蛋白沉积的iBBB组合都只含有APOE3/3 iMCs，而所有高淀粉样蛋白沉积的组合都只含有APOE4/4 iMCs。替换实验进一步证实：仅将APOE4/4 iMCs替换为APOE3/3来源的iMCs，就能显著降低APOE4背景iBBB的Aβ沉积；反之，将APOE3/3 iMCs替换为APOE3/4（杂合）iMCs，则能增加淀粉样蛋白沉积。此外，APOE4/4 iMCs的条件培养基足以诱导APOE3/3 iBBB增加Aβ积累。这些结果强有力地证明，APOE4 iMCs是导致iBBB中Aβ过度沉积的必要且充分条件。
第三部分：探究APOE4周细胞中APOE表达上调的分子机制——钙调神经磷酸酶/NFAT信号通路的作用。 为了解APOE4 iMCs促进Aβ沉积的分子基础，研究者对同基因的APOE3/3和APOE4/4 iMCs进行了RNA测序。差异表达基因分析显示，APOE基因本身在APOE4 iMCs中显著上调（而在APOE4星形胶质细胞中下调）。这一发现在蛋白水平和多个独立的iPSC系中得到了验证。更重要的是，对来自人类前额叶皮层和海马体的死后脑组织单细胞核RNA测序数据的分析表明，在APOE4携带者中，周细胞（而非内皮细胞）的APOE mRNA表达确实选择性升高。免疫组化也证实APOE4携带者脑内NG2阳性周细胞中的APOE蛋白水平更高。鉴于已知ApoE蛋白对CAA病理是必需的，研究者推测iMCs中APOE的上调驱动了Aβ沉积。实验证实，敲除APOE基因（APOE-KO）或通过免疫沉淀去除APOE4 iMCs条件培养基中的ApoE蛋白，都能显著减少Aβ积累；而外源添加重组ApoE蛋白则会增加Aβ沉积。接下来，研究转向探索APOE上调的转录调控机制。转录因子差异表达分析发现，在APOE4 iMCs中，NFAT（活化T细胞核因子）家族的NFAT5和NFATC1显著上调。NFAT的活性受钙调神经磷酸酶（Calcineurin, CaN）调控：CaN使NFAT去磷酸化，促使其入核激活靶基因。进一步分析发现，APOE4 iMCs中CaN的催化亚基（PPP3CA， PPP3CC）表达升高，而CaN的负调控因子（RCAN2， RCAN3）和能使NFAT滞留在胞浆的激酶DYRK4表达下调。这些变化共同指向APOE4 iMCs中存在CaN/NFAT信号通路的过度激活。蛋白检测显示，APOE4 iMCs中胞浆和核内的NFATC1蛋白水平均升高。对人类脑组织数据的再分析证实，APOE4携带者海马周细胞（而非内皮细胞）中的NFATC1和NFATC2 mRNA水平显著高于非携带者。
第四部分：抑制钙调神经磷酸酶/NFAT信号通路可降低APOE表达并改善病理。 基于上述发现，研究测试了抑制CaN/NFAT通路能否逆转APOE4的表型。使用三种结构不同的CaN抑制剂（环孢素A， FK506， INCA-6）处理APOE4 iMCs两周后，APOE的mRNA和蛋白表达均显著下降。环孢素A处理使APOE4 iMCs的整体转录谱变得更接近APOE3 iMCs。在iBBB模型中，用环孢素A或FK506预处理，能显著减少APOE4 iBBB的Aβ积累。来自经CaN抑制剂处理的APOE4 iMCs的条件培养基，也失去了诱导APOE3 iBBB增加Aβ沉积的能力。为了验证这一发现在体内的潜在治疗价值，研究在APOE4基因敲入小鼠与5xFAD小鼠杂交的AD模型中进行测试。对6月龄小鼠进行为期三周的环孢素A腹腔注射治疗后，海马区可溶性ApoE蛋白水平下降，脑内周细胞周围的ApoE蛋白染色减少，同时血管淀粉样蛋白沉积（通过6E10和12F4抗体检测）也显著减轻。原代分离的APOE4小鼠脑周细胞在体外经CaN抑制剂处理后，其APOE mRNA表达同样下降。
本研究得出的核心结论是：APOE4基因型通过选择性上调人脑周细胞中的钙调神经磷酸酶/NFAT信号通路，导致周细胞过度产生ApoE蛋白，进而驱动脑血管中β-淀粉样蛋白的异常积累，这是脑淀粉样血管病发生的关键机制之一。
本研究的科学价值与应用意义重大。首先，它成功开发并验证了一个高度仿生、功能完整的人类iPSC来源三维BBB模型（iBBB），为研究人类脑血管生物学、神经血管单元在健康和疾病中的作用，以及药物跨越BBB的筛选提供了强大的新型平台工具。其次，研究首次将APOE4的致病风险精准定位到BBB中的周细胞这一特定细胞类型，并阐明了其下游的分子通路（CaN/NFAT信号轴），深化了对AD和CAA发病机制的理解，挑战了以往主要关注星形胶质细胞和神经元的视角。第三，研究不仅揭示了机制，还通过体外和体内实验证明，抑制CaN/NFAT通路能够有效降低APOE4周细胞的ApoE表达并减轻血管淀粉样病变，这为开发针对APOE4携带者的CAA乃至AD的靶向治疗策略提供了直接的、药理上可行的新靶点。文中还提到，长期服用环孢素A或FK506（均为CaN抑制剂）的临床患者群体中痴呆发病率较低，本研究为此临床观察提供了可能的机制解释，进一步增强了该靶点的转化医学潜力。
本研究的亮点突出体现在多个方面。在方法学上，首创性地构建了包含三种细胞、具有体内BBB关键解剖与生理特征的三维体外模型，并进行了系统、严格的功能验证。在研究思路上，巧妙运用同基因iPSC系、组合细胞替换筛选、条件培养基转移等实验设计，清晰、令人信服地确定了APOE4周细胞是致病的关键环节。在机制探索上，从转录组学到单细胞测序数据分析，从体外模型到动物模型验证，层层递进，完整地勾勒出“APOE4基因 → 周细胞CaN/NFAT信号异常激活 → APOE表达上调 → ApoE蛋白介导的Aβ血管沉积增加”这一致病轴。最后，研究成果具有明确的转化价值，将基础研究发现与现有临床药物及观察相联系，为老药新用或新药开发指明了方向。
此外，研究中对iMCs身份的严谨鉴定（通过对比体内单细胞转录组数据）、对BBB功能属性的多维度评估（结构、基因表达、TEER、渗透性、外排泵极性），以及对人类死后脑组织数据的深度挖掘和验证，都体现了研究工作的系统性和严谨性，增强了结论的可靠性。