本研究的主要作者为Xin Jiang、Laure Schaeffer、Divya Patni等人。通讯作者为Franck Martin（隶属法国斯特拉斯堡大学分子与细胞生物学研究所，CNRS UPR9002）和Clotilde Lagier-Tourenne（隶属美国麻省总医院神经科、哈佛医学院及Broad研究所）。该研究以题为“Blocking RAN translation without altering repeat RNAs rescues C9orf72-related ALS and FTD phenotypes”的论文形式，发表于Science期刊的2026年2月5日第573期。
学术背景 本研究属于神经科学领域，具体聚焦于神经退行性疾病肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）和额颞叶痴呆（Frontotemporal Dementia, FTD）的致病机制研究。C9orf72基因内含子1中GGGGCC（G4C2）六核苷酸重复序列扩增是家族性ALS和FTD最常见的遗传病因。这种重复扩增会产生两种主要的潜在毒性来源：其一，包含重复序列的RNA（包括正义链和反义链）在细胞核内积聚形成“RNA病灶”，被认为可能通过螯合RNA结合蛋白而致病；其二，这些重复RNA通过一种非常规的、不依赖AUG起始密码子的“重复序列相关非AUG翻译”（Repeat-Associated Non-AUG translation， RAN翻译）机制，被翻译成五种二肽重复蛋白（Dipeptide Repeat Proteins, DPRs），包括聚甘氨酸-丙氨酸（poly-GA）、聚甘氨酸-脯氨酸（poly-GP）、聚甘氨酸-精氨酸（poly-GR）、聚脯氨酸-丙氨酸（poly-PA）和聚脯氨酸-精氨酸（poly-PR）。长期以来，区分RNA毒性和DPR毒性在疾病中的相对贡献至关重要，因为这将直接影响治疗策略的开发（例如，是靶向降解重复RNA，还是抑制DPR的产生）。然而，由于DPR是直接从重复RNA翻译而来，在技术上很难将这两种毒性机制截然分开，这使得阐明核心致病驱动因素颇具挑战。
之前的研究试图通过在不同模型中使用被终止密码子间断的重复序列（以阻断DPR产生但保留RNA）或使用短重复序列等方法进行区分，但结果存在矛盾。一些证据支持DPR是主要毒性来源，而另一些研究则提示RNA本身也可能致病。因此，迫切需要一种能够在完整保留重复RNA表达和结构的同时，特异性阻断DPR产生的方法，以明确回答这个根本问题。基于先前发现，位于G4C2重复序列上游24个核苷酸处的一个近同源翻译起始密码子CUG（位于poly-GA阅读框中），是启动所有三种阅读框（poly-GA、-GP、-GR）DPR翻译的主要位点，且涉及核糖体移码机制。本研究的核心目标是：通过对这个特定的CUG密码子进行单核苷酸编辑（突变为CCG），在动物模型和患者来源的细胞中特异性破坏DPR的合成，同时不干扰重复RNA的表达和RNA病灶的形成，从而精确评估DPR在C9orf72相关ALS/FTD发病机制中的独立作用。
详细研究流程 本研究是一个多平台、多层次的系统性验证工作，主要流程可概括为体外验证、小鼠体内模型验证和患者来源干细胞模型验证三大部分。
第一部分：体外验证CUG密码子的作用及突变对RNA结构的影响 首先，研究团队在体外验证了CUG→CCG突变对DPR产生的阻断作用。他们使用了人胚肾细胞（HEK293T）的无细胞翻译提取物或细胞系，表达了带有66个G4C2重复序列的构建体，并在上游引入了CUG或CCG密码子。通过免疫沉淀结合蛋白质印迹分析，他们证实了针对CUG上游N端肽段（与poly-GA框内）的抗体能够同时下拉出带有poly-GA、poly-GP和poly-GR标签的蛋白质，这为核糖体移码机制提供了直接证据。而将CUG突变为CCG后，所有三种阅读框的DPR产生均被显著破坏。
为了确保CCG突变没有改变重复RNA的二级结构（从而可能影响RNA结合蛋白的互作，即潜在的RNA毒性机制），研究进行了RNA结构探测实验。他们采用了“原位探测”（in-line probing）和“RNase S1探测”两种方法，对含有CUG或CCG的(G4C2)66转录本进行了分析。结果表明，CUG→CCG突变仅引起了突变位点附近局部结构的微小变化，而整个mRNA的总体结构，特别是G4C2重复区域的结构，在突变前后保持不变。这为后续在体实验中“特异性阻断DPR而保留RNA毒性可能”的设计提供了关键的理论支持。
第二部分：在C9orf72小鼠模型中验证CUG→CCG突变的效果 研究构建了两种不同的腺相关病毒（AAV）介导的转基因小鼠模型。第一种模型在新生小鼠侧脑室注射AAV，使其表达带有66个G4C2重复序列，且上游为野生型CUG [CUG-(G4C2)66] 或突变型CCG [CCG-(G4C2)66] 的转录本。对照组小鼠注射仅含2个重复的构建体。小鼠被饲养至10或15月龄，进行纵向的行为学分析和病理学检查。第二种模型使用了更长的重复序列，分别表达149个（CUG-(G4C2)149）或158个（CCG-(G4C2)158）重复，以验证在较长重复下该策略的有效性。
在小鼠模型中的研究流程包括： 1. 验证RNA表达与DPR产生：通过荧光原位杂交（FISH）和定量PCR证实，CUG和CCG小鼠大脑皮层中G4C2重复RNA的表达水平以及形成RNA病灶的细胞比例没有差异。然而，通过免疫染色、蛋白质印迹、斑点印迹以及使用一种高灵敏度的电化学发光免疫检测技术（Meso Scale Discovery, MSD），均一致发现CCG突变小鼠大脑中的poly-GA、poly-GR以及来自正义链的poly-GP（使用特异性C端抗体检测）的积累被大幅减少甚至完全阻断。有趣的是，使用能同时检测正义和反义链poly-GP的抗体时，在CCG小鼠中仍能检测到信号，这与该突变仅影响正义链翻译、而反义链翻译仍产生poly-GP的预期相符。这些结果证实，单核苷酸突变在体内高效阻断了主要DPR的合成。 2. 行为学表型拯救：对小鼠进行了一系列行为学测试。表达CUG-(G4C2)66或149重复的小鼠表现出明显的运动缺陷（在倒置网格悬挂和悬丝测试中表现不佳）、活动过度（在旷场实验中总移动距离和速度增加）以及刻板行为异常（埋珠实验埋珠数减少）。所有这些行为异常在对应的CCG突变小鼠中都得到了显著改善或完全拯救。 3. 病理学与分子表型拯救：研究对小鼠脑组织进行了全面的病理学分析： * TDP-43病理：C9orf72患者和模型的一个重要特征是TDP-43蛋白的异常磷酸化和聚集。免疫组化显示，CUG-66R小鼠皮层中存在磷酸化TDP-43（p-TDP-43）包涵体，而在CCG-66R小鼠中则未检测到。 * 神经丝轻链：血浆神经丝轻链（NfL）是神经元损伤的血液生物标志物。CUG小鼠血浆NfL水平升高，而在CCG小鼠中恢复至正常水平。 * 神经元丢失与先天免疫激活：研究发现CUG小鼠皮层第V层的运动神经元（CTIP2阳性）数量减少，存活的神经元中显示STING蛋白和磷酸化TBK1（p-TBK1）的异常积聚，这提示cGAS-STING先天免疫通路被激活。在CCG小鼠中，神经元丢失减轻，STING/p-TBK1的异常积聚也显著减少。 * 神经炎症：CUG小鼠皮层中星形胶质细胞（GFAP阳性）和小胶质细胞（CD68阳性）活化增加，表现为典型的神经炎症反应。而在CCG小鼠中，这种胶质细胞活化被完全抑制。 * 泛素化积累：CUG小鼠脑组织不溶蛋白组分中泛素和K48连接的多聚泛素化蛋白水平升高，表明蛋白质稳态受损，这一现象在CCG小鼠中得到缓解。
第三部分：在C9orf72患者诱导多能干细胞（iPSC）衍生神经元中验证 为了在更接近人类疾病的环境中验证这一策略，研究团队从C9orf72 ALS/FTD患者身上获取了iPSC。他们利用CRISPR腺嘌呤碱基编辑器（Base Editor），精确地将患者iPSC中C9orf72等位基因上的CUG密码子编辑为CCG，同时保留了重复序列本身，从而建立了同基因型对照的细胞系（即遗传背景相同，仅该位点不同）。 1. 神经元分化与DPR检测：将编辑前后的iPSC分化为运动神经元（使用多种分化方案，包括过表达转录因子NGN2/ISL1/LHX3或使用小分子化合物诱导）。MSD免疫检测证实，在CCG编辑的神经元中，poly-GA和poly-GP的水平相比未编辑的C9orf72神经元显著降低（虽然未完全降至健康对照水平，可能由于存在次要的翻译起始位点或反义链翻译）。 2. 转录组学拯救：对分化的运动神经元进行RNA测序（RNA-seq）分析。与健康对照相比，C9orf72神经元中有近2000个基因表达发生显著改变。其中，约43%的转录组变化在CCG编辑的神经元中得到“拯救”（即表达水平恢复至接近对照）。基因本体分析显示，被拯救的基因富集在离子通道功能和细胞外基质相关通路上，这些通路此前已被报道在C9orf72疾病中失调。 3. 细胞表型拯救：一系列细胞功能实验表明，CCG编辑能显著改善疾病相关表型： * 神经元存活：长期活细胞成像显示，CCG编辑的C9orf72运动神经元的存活率显著高于未编辑的神经元。 * 应激敏感性：当用衣霉素（诱导内质网应激）处理时，C9orf72神经元表现出更高的死亡敏感性，而CCG编辑使其抵抗力增强。 * 神经突形态：C9orf72神经元表现出神经突密度降低和微管不稳定性增加，这两个表型在CCG编辑后得到改善。 * 核孔复合体定位：超高分辨率显微镜（STED）显示，C9orf72神经元中核孔复合体蛋白出现异常定位（可能与核膜内陷有关），而CCG编辑减少了这种异常。 * STING通路激活：与小鼠模型一致，患者iPSC衍生的皮层神经元中也观察到细胞质STING的积累，该表型在CCG编辑后被逆转。
主要研究结果 本研究在每个阶段都获得了清晰且相互印证的结果。体外实验确认了CUG密码子对多阅读框DPR产生的关键作用，以及CCG突变在保留RNA结构前提下的特异性阻断能力。在小鼠模型中，尽管RNA病灶持续存在，但CCG突变几乎完全阻止了主要DPR的产生，并随之全面挽救了运动与认知行为缺陷、神经元丢失、TDP-43病理、STING-TBK1通路激活、神经炎症以及血浆NfL升高等一系列从行为到分子层面的疾病表型。在患者iPSC衍生神经元中，精确的碱基编辑同样显著降低了DPR水平，并部分或完全挽救了转录组紊乱、神经元存活率下降、神经突缺陷、核孔运输异常和先天免疫激活等多种细胞疾病表型。这些跨模型的一致性结果强有力地表明，疾病的驱动力量主要来自于DPR的毒性，而非重复RNA本身。RNA病灶的存在本身并不足以引发显著的神经退行性表型。
结论与意义 本研究得出明确结论：在C9orf72相关的ALS和FTD中，由RAN翻译产生的二肽重复蛋白（DPRs）是疾病发病机制的主要驱动因素，而非包含重复序列的RNA。尽管RNA病灶持续存在，但特异性阻断DPR的合成足以在动物模型和人类患者来源的神经元中挽救广泛的疾病表型。
这项研究的科学价值在于，它首次通过一种精妙的遗传学干预手段（单核苷酸编辑），在完整保留致病性重复RNA的前提下，直接、干净地分离了DPR毒性与RNA毒性，为这场长期的学术争论提供了迄今最直接的证据。这深刻改变了我们对C9orf72疾病核心致病机制的理解，将治疗研发的焦点更清晰地指向了DPR相关通路。
其应用价值更为显著：它为ALS/FTD的治疗开发提供了全新的、有潜力的策略方向。当前，许多疗法旨在降低C9orf72重复RNA的水平（例如使用反义寡核苷酸ASO）。然而，近期两项靶向C9orf72的ASO临床试验终止，凸显了探索替代策略的必要性。本研究提示，可以不必追求清除重复RNA，而是转向干预其下游的、更具毒性的产物——DPR。具体策略可以包括：开发小分子或基因疗法来抑制RAN翻译起始（例如靶向CUG起始复合物）、促进DPR的清除、或中和其毒性。靶向DPR合成可能提供一个更安全、更有效的治疗窗口。
研究亮点 1. 机制研究的创新性：研究没有使用传统的“敲低”或“过表达”来粗暴干预，而是利用对RAN翻译起始机制的深入理解，设计了一个“功能性分离”突变（CUG→CCG），如同一个精密的“分子开关”，只关闭DPR生产而不影响RNA，这是方法学上的重大创新。 2. 证据链的完备性与说服力：研究综合运用了体外生化、两种不同重复长度的小鼠模型、患者iPSC衍生神经元模型以及多种先进技术（如碱基编辑、超高分辨率成像、高灵敏度免疫检测、转录组学等），从分子、细胞、组织到整体行为水平提供了多层次、相互佐证的坚实数据，证据链非常完整。 3. 明确的转化医学启示：研究结论直接指向了全新的治疗靶点（DPR合成通路），为目前遭遇瓶颈的C9orf72 ALS/FTD药物研发开辟了新的道路，具有明确的临床转化前景。 4. 对相关疾病的启发：该研究策略和结论可能对其它由重复扩增引起、同样存在RAN翻译现象的神经退行性疾病（如脆性X相关震颤/共济失调综合征FXTAS）的机制研究和治疗开发具有借鉴意义。