本研究由Hao Sun、Dan Wang、Jingqi Ren、Jiaxi Liu、Zhe Wang、Xinyan Wang、Anying Zhang、Kun Yang、Mu Yang和Hong Zhou*共同完成，其中通讯作者Hong Zhou来自电子科技大学生命科学与技术学院，其他作者分别来自同一学院及四川省肿瘤医院转化医学研究中心。研究成果发表于2023年10月5日的《Fish and Shellfish Immunology》期刊（Volume 142, 109145）。
学术背景
该研究聚焦于水产养殖中由嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila, A. hydrophila）引发的铁依赖性氧化损伤问题。嗜水气单胞菌是淡水鱼类常见病原体，可导致铁沉积、脂质过氧化和抗氧化系统紊乱，但其通过铁死亡（ferroptosis）途径的致病机制尚不明确。维生素D3（VD3）作为鱼类必需营养素，此前被报道具有抗氧化功能，但其在鱼类免疫防御中的分子机制缺乏深入研究。本研究旨在揭示VD3通过调控核因子E2相关因子2（Nrf2）介导的抗氧化通路，缓解嗜水气单胞菌诱导的铁死亡损伤的作用机制。
研究流程
病理学观察
- 对象与处理：健康草鱼（Ctenopharyngodon idella，平均体重50.12±5.17 g）分为对照组、VD3处理组、嗜水气单胞菌感染组及VD3联合感染组（每组30尾）。感染剂量为8×10⁷ CFU/kg（腹腔注射）。
- 方法：通过普鲁士蓝染色（Prussian blue staining）和吉姆萨染色（Giemsa staining）观察脾脏铁沉积和巨噬细胞浸润；检测脾脏丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）含量。
- 创新点：首次在草鱼模型中证实嗜水气单胞菌感染引发脾脏铁沉积与巨噬细胞聚集，提示铁死亡可能参与病理过程。
体外细胞实验
- 模型构建：分离草鱼脾脏巨噬细胞，建立嗜水气单胞菌感染模型（MOI=10）。
- 干预措施：
- 使用铁死亡诱导剂（Erastin、RSL3）和抑制剂（Liproxstatin-1、Ferrostatin-1）验证铁死亡表型。
- 1,25-二羟基维生素D3（1,25D3，VD3活性形式）预处理12小时后感染细菌。
- 检测指标：
- 流式细胞术（Flow cytometry）检测细胞内游离Fe²⁺和脂质ROS（C11-BODIPY581/591探针）。
- Western blot分析铁输出蛋白（Ferroportin1, FPN1）、铁储存蛋白（Ferritin）及谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）表达。
- 酶活性检测γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（γ-GCL）活性。
- 技术亮点：通过shRNA敲降维生素D受体（VDR），证实1,25D3的作用依赖VDR信号通路。
分子机制解析
- Nrf2通路调控：
- 使用Nrf2抑制剂ML385证明1,25D3通过Nrf2上调GPX4和GSH合成。
- 蛋白质稳定性实验（环己酰亚胺CHX处理）和泛素化分析显示，1,25D3通过抑制Nrf2泛素化降解增强其蛋白稳定性。
- 数据支持：1,25D3使核内Nrf2蛋白水平提升2.3倍（p<0.01），泛素化程度降低40%。
体内验证
- 处理方案：腹腔注射1,25D3（0.2 μg/kg，隔日一次，共4次）后感染嗜水气单胞菌。
- 结果：
- 1,25D3显著提高感染后96小时存活率（从45%升至78%，p<0.01）。
- 脾脏铁沉积减少50%，MDA含量下降62%，GSH水平恢复至对照组85%。
主要结果
- 病理特征：嗜水气单胞菌感染导致草鱼脾脏铁沉积（普鲁士蓝阳性区域增加3倍）和巨噬细胞聚集（吉姆萨染色显示细胞密度提升2.5倍）。
- 铁死亡抑制：1,25D3降低感染后巨噬细胞内Fe²⁺水平（流式检测阳性细胞比例从38%降至15%），并逆转细菌诱导的FPN1蛋白下调（Western blot显示表达量恢复1.8倍）。
- 抗氧化调控：1,25D3通过VDR-Nrf2轴使GPX4蛋白表达提升2.1倍，GSH含量增加1.7倍（p<0.001）。
- 体内保护：1,25D3处理组脾脏MDA含量从12.5 nmol/mg降至4.8 nmol/mg（p<0.01）。
结论与价值
本研究首次阐明：
1. 科学价值：揭示VD3通过VDR-Nrf2-GPX4/GSH通路抑制嗜水气单胞菌诱导的铁死亡，为鱼类免疫代谢调控提供新机制。
2. 应用价值：提出VD3可作为非抗生素策略防治细菌性鱼病，降低水产养殖中氧化损伤导致的死亡率。
研究亮点
- 创新发现：首次将铁死亡机制与鱼类细菌感染病理关联，并明确VD3的干预靶点。
- 方法学贡献：建立草鱼脾脏巨噬细胞铁死亡模型，开发基于泛素化分析的Nrf2稳定性检测方案。
- 跨物种意义：为哺乳动物VD3抗氧化研究提供进化保守性证据。
其他价值
研究数据可通过申请获取，补充材料包含引物序列（Supplementary Table 1）及详细实验步骤，有助于方法复现。