关于弗里德赖希共济失调小鼠模型性别二态性的研究报道

一、 研究团队与发表信息 本研究由美国加州大学戴维斯分校分子生物科学系的 Elena N. Dedkova 教授团队主导，主要作者包括 Lili Salinas、Claire B. Montgomery、Francisco Figueroa、Phung N. Thai 等人，合作者来自加州大学戴维斯分校内科系、退伍军人事务部北加州医疗系统以及加州北州立大学。该研究以题为《Sexual dimorphism in a mouse model of Friedreich’s ataxia with severe cardiomyopathy》的论文形式，于2024年发表在《Communications Biology》期刊上（文章ID：10.1038/s42003-024-06962-4）。

二、 学术背景与研究目标 本研究属于神经退行性疾病和心血管疾病的交叉领域，聚焦于弗里德赖希共济失调。弗里德赖希共济失调（Friedreich’s ataxia, FA）是一种由FXN基因内含子1区GAA三核苷酸重复扩增引起的常染色体隐性遗传病，导致线粒体蛋白frataxin表达减少。该病虽表现为小脑性共济失调，但其致死主因是左心室心肌病的发生和发展。尽管有多种FA小鼠模型，但能准确再现患者心肌病特征并用于有效治疗评估的模型仍然稀缺。临床观察有限的数据提示，男性FA患者可能表现出更严重的心脏肥厚和功能下降，但这种性别差异的机制不明，也未在动物模型中得到系统研究。

因此，本研究旨在详细表征一种新型的条件性FXN基因敲除小鼠模型（FXNflox/null::MCK-Cre，简称FXN-CKO），该模型因心脏特异性FXN缺失而快速进展为严重心肌病并过早死亡。研究的核心目标是：1) 全面描述该模型的心脏表型、生存率及其他器官受累情况；2) 探究在该模型中是否存在显著的性别二态性（Sexual dimorphism）；3) 如果存在性别差异，深入揭示其潜在的分子与生理机制。

三、 详细研究流程与方法 研究设计主要包含生存分析、横断面功能与分子表征两大队列，并采用了多学科交叉的实验手段。

1. 动物模型与实验设计：

   • 研究对象： 使用FXN-CKO小鼠（实验组）及其同窝对照（Control, Ctrl）小鼠。实验组小鼠携带一个flox的FXN外显子2等位基因和一个全局敲除等位基因，并在肌肉肌酸激酶（MCK）启动子驱动下表达Cre重组酶，从而实现心脏、骨骼肌及MCK表达的其他组织（如肾脏特定部位、睾丸支持细胞和间质细胞等）中FXN的条件性敲除。
   • 队列设计：
     • 生存队列（n=20）： 包含10只雄性和10只雌性FXN-CKO小鼠，每日监测直至自然死亡，绘制卡普兰-迈耶生存曲线，记录体重变化。
     • 横断面队列（n=每性别组约7-10只）： 在预生存研究确定的死亡发生前（8周龄），对Ctrl和FXN-CKO的雄性和雌性小鼠进行功能测试，随后处死并收集组织样本进行后续分析。

2. 表型与功能评估流程：

   • 心脏结构与功能： 使用VisualSonics Vevo 2100超声心动图系统，在麻醉（结构评估）或清醒（M-模式功能评估）状态下，对小鼠进行经胸超声检查。测量并计算心外膜面积、左心室（LV）收缩/舒张末期内径和容积、左室质量、射血分数（Ejection Fraction， EF）、短轴缩短率（Fractional Shortening， FS）、每搏输出量、心输出量以及心室壁厚度等一系列参数。
   • 器官重量与形态： 处死后，称量心脏、肾脏、睾丸/卵巢重量，并使用胫骨长度进行标准化，以评估器官肥大或萎缩。对心脏组织进行马松三色染色，量化纤维化面积百分比。
   • 肾脏功能评估： 采集血清，送至合作实验室（UC Davis比较病理学实验室）使用Roche Integra 400 plus进行生化分析，检测指标包括淀粉酶、肌酐、血尿素氮（BUN）、钙、氯、磷、钠等，以评估肾脏功能与电解质平衡。

3. 分子与生化机制探究流程：

   • 基因表达分析： 使用Qiagen试剂盒从心脏、肾脏、睾丸、卵巢组织提取总RNA，反转录为cDNA后，采用SYBR Green染料在QuantStudio 7 Pro实时定量PCR系统上进行qRT-PCR。检测的基因包括：FXN（验证敲除效率）、纤维化标志物（Lgals3， Postn）、心力衰竭标志物（Nppb）、睾酮合成通路相关基因（Star， Tspo， Cyp11a1， Fdx1）、心脏兴奋-收缩偶联关键蛋白基因（Cacna1c， Cacna1d， Atp2a2， Ryr2， Pln， Ncx1， Camk2d， Nos3）等。使用18S rRNA或β-actin作为内参基因进行相对定量。
   • 蛋白表达分析： 使用蛋白质裂解液提取心脏组织总蛋白，通过Jess全自动蛋白质印迹系统（ProteinSimple）检测Frataxin蛋白水平，以α-tubulin作为内参。
   • 激素与代谢物检测： 使用商业ELISA试剂盒检测血清中的睾酮、雌二醇和维生素D水平。使用ELISA法测定血清高密度脂蛋白和低密度脂蛋白胆固醇。
   • 线粒体功能评估： 使用Abcam公司的商用试剂盒，分别检测心脏组织线粒体复合物I和II的活性、ATP水平以及顺乌头酸酶活性，以评估FA模型中典型的线粒体功能障碍是否表现出性别差异。

4. 数据分析方法：

   • 所有数据均以均值±标准误表示。主要使用GraphPad Prism软件进行双因素方差分析（Two-way ANOVA），以比较基因型（Ctrl vs. CKO）和性别（雄性 vs. 雌性）的主效应及交互作用。生存曲线采用对数秩检验。以p < 0.05为具有统计学显著性。

四、 主要研究结果及其逻辑关联 研究结果揭示了FXN-CKO模型中广泛而显著的性别二态性，雄性小鼠在多个方面表现出更严重的表型。

1. 生存与心脏表型差异： FXN-CKO雄性小鼠的死亡时间显著早于雌性（中位生存期：雄性71.5天 vs. 雌性81.5天），体重增长更早停滞并出现更严重的下降。超声心动图显示，与各自对照组相比，FXN-CKO雄性和雌性小鼠均发展为扩张型心肌病伴射血分数降低，但雄性受损更严重：其左室收缩末容积增加24倍（雌性为13倍），射血分数下降约70%（雌性下降约39%），心输出量下降33%（雌性仅呈下降趋势）。心脏重量/胫骨长度比值和纤维化程度在雄性中也增加得更多。这些结果直接解释了雄性生存期更短的原因，并提示存在性别特异的病理加重机制。

2. FXN敲除效率与多器官受累： qRT-PCR和蛋白质印迹证实，雄性和雌性FXN-CKO小鼠心脏中FXN的基因和蛋白表达下降程度相似（均剩余约15%），排除了敲除效率差异是表型二态性的原因。研究意外发现，FXN-CKO雄性小鼠出现明显的肾脏萎缩（肾脏重量/胫骨长度下降23%），而雌性变化不显著。血清生化显示，仅雄性小鼠出现肌酐、BUN显著升高，以及血钙、血氯水平异常。同时，雄性小鼠睾丸重量减轻，血清睾酮水平显著降低28%，而雌性小鼠的卵巢重量和血清雌二醇水平无显著变化。这些发现将研究焦点从单一心脏病变引向了多系统受累，特别是将睾酮水平下降与更差的整体预后（心脏、肾脏）联系起来。

3. 睾酮合成通路受损的机制： 为了探究睾酮下降的原因，研究人员检测了性腺中睾酮合成通路的关键分子。发现FXN-CKO雄性小鼠睾丸中，负责将胆固醇从线粒体外膜转运至内膜的蛋白Star基因表达大幅下降（-48%），负责胆固醇侧链裂解生成孕烯醇酮的线粒体内膜酶Cyp11a1（P450scc）及其电子传递伙伴Fdx1（一种铁硫簇蛋白）的表达也显著降低。同时，外周型苯二氮卓受体Tspo的表达在雄性和雌性中均下降。这些数据表明，FXN缺失通过影响线粒体胆固醇转运和铁硫簇依赖的酶促反应，特异性损害了雄性睾丸Leydig细胞内的睾酮生物合成关键步骤。

4. 心脏兴奋-收缩偶联蛋白表达的性别差异： 鉴于性激素对心脏离子通道有调节作用，研究检测了心脏钙信号通路关键蛋白的基因表达。结果显示，与雌性相比，FXN-CKO雄性小鼠心脏中L型钙通道（Cacna1c， Cacna1d）、肌浆网钙泵（Serca2）、兰尼碱受体（Ryr2）、受磷蛋白（Pln）的基因表达下降更为显著。值得注意的是，与压力超负荷等经典心衰模型通常上调Na+/Ca2+交换体（Ncx1）和CaMKIIδ不同，FA心肌病模型中两者的表达是下调的，且雄性下调更甚。内皮型一氧化氮合酶（Nos3）的表达也仅在雄性中显著下降。这一系列发现将睾酮缺乏与更严重的心脏电生理和收缩功能分子基础的破坏直接关联。

5. 线粒体功能无性别二态性： 作为FA的核心病理环节，研究者检测了线粒体功能。结果发现，FXN-CKO雄性和雌性小鼠心脏的顺乌头酸酶活性、线粒体复合物I和II活性以及ATP水平均出现同等程度的严重下降（约60-80%的下降）。这表明基础的、FXN缺失直接导致的线粒体能量代谢障碍在两性中是相似的，不是性别差异的来源，从而反衬出性激素及其下游信号通路在修饰疾病严重程度上扮演了关键角色。

五、 研究结论与意义价值 本研究得出结论：在FXN-CKO这一严重FA心肌病小鼠模型中，存在显著的性别二态性。雄性小鼠表现出更早死亡、更严重的心脏收缩功能障碍、更显著的肾脏损伤以及睾酮水平显著下降。这种二态性并非源于FXN敲除效率或核心线粒体能量障碍的差异，而是与雄性特异性睾酮合成通路受损密切相关。睾酮下降可能通过恶化心脏兴奋-收缩偶联关键蛋白的表达，加剧了心功能不全和整体疾病进程。

科学价值： 1. 模型表征与验证： 首次系统表征了FXNflox/null::MCK-Cre模型作为终末期FA心肌病模型的详细表型，并确认其能再现临床观察到的男性患者心脏受累更重的趋势，提升了该模型的临床相关性。 2. 机制新发现： 首次在FA模型中揭示了性激素（特别是睾酮）水平变化是疾病严重程度性别差异的关键调节因素，并将FXN缺失与睾酮合成线粒体通路（Star， Fdx1）的功能障碍直接联系起来。 3. 病理生理新视角： 指出了FA不仅是一个神经和心脏疾病，还可能涉及肾脏和内分泌系统（性腺）的多系统障碍，拓宽了对FA全身性影响的认识。 4. 治疗启示： 研究提示，针对FA的疗法开发需考虑性别因素，并且对于男性患者，睾酮补充或替代疗法是否可能成为一种辅助治疗策略，值得进一步探索。同时，研究强调FA心肌病的分子特征（如NCX1和CaMKIIδ下调）与经典心衰不同，暗示可能需要个性化的治疗方案。

应用价值： 该研究强烈建议，在使用此类FA小鼠模型进行药物疗效评估时，必须将性别作为关键变量纳入实验设计和数据分析，以避免因性别差异导致的偏倚或结果误读，从而提高临床前研究的预测价值。

六、 研究亮点 1. 重要发现： 明确揭示了FA小鼠模型中此前未被充分认识的性别二态性，并将这种差异的机制锚定在睾酮合成通路的功能障碍上，是领域内的一项重要进展。 2. 研究方法的全面性： 采用了从整体动物生存、多器官影像与功能评估，到分子、生化、激素水平的跨层次、多系统整合分析策略，逻辑链条完整，证据扎实。 3. 临床关联性强： 研究始于对有限临床观察（男性患者心脏指标更差）的求证，并在动物模型中不仅证实了这一点，还深入挖掘了潜在机制，实现了从临床问题到基础研究再反哺临床认知的闭环。 4. 关注点新颖： 将研究视角从FA的传统焦点——神经和心脏线粒体功能障碍，拓展至肾脏和内分泌性腺系统，提出了FA作为多系统疾病的新见解。

七、 其他有价值的发现 本研究还报告了FA心肌病中一个与众不同的分子特征：即心脏Na+/Ca2+交换体（NCX1）和CaMKIIδ的表达是下调而非上调的，这与大多数其他原因导致的扩张型心肌病和心衰模型相反。这一发现提示，FA心肌病的发生发展可能存在独特的细胞钙处理紊乱机制，未来针对钙调控的疗法需要基于FA特有的病理信号进行设计，而不能简单套用常规心衰的治疗策略。此外，研究中观察到的肾脏受累与电解质紊乱，也与近期在FA患者临床试验中观察到的肾功能下降趋势相呼应，为关注FA患者的肾健康提供了临床前依据。