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这篇研究由Carolina E. Hagberg、Qian Li、Maria Kutschke等人完成，主要作者来自瑞典卡罗林斯卡研究所/AstraZeneca综合心血管代谢中心（KI/AZ ICMC）和卡罗林斯卡研究所细胞与分子生物学系。该研究发表于2018年9月4日的《Cell Reports》期刊。
学术背景
脂肪细胞曾被认为只是简单的脂质储存细胞，但近年来它们被发现具有多种复杂的生物功能。流式细胞术是一种强大的高通量分析单细胞的方法，然而，由于新鲜分离的脂肪细胞的大尺寸、脆弱性和高浮力，使用流式细胞术对其进行分析一直是一个挑战。现有的方法在检测大多数白色脂肪细胞方面存在不足，并且难以区分不同类型的脂肪细胞。因此，开发一种有效的流式细胞术方法来分析和分选小鼠和人类脂肪细胞，对于研究这些特殊细胞类型至关重要。
本研究旨在提供一种详细的流式细胞术协议，用于分析和分选小鼠和人类的白色、棕色和米色（brite/beige）脂肪细胞，以解决现有技术中的缺陷并推进对脂肪细胞异质性的理解。
详细工作流程
该研究包括多个步骤：
样本制备：
- 从小鼠和人类的白色脂肪组织（WAT）、棕色脂肪组织（BAT）中分离出脂肪细胞和基质血管部分（SVF）细胞。
- 使用胶原酶消化组织后，通过过滤和洗涤获得纯净的脂肪细胞悬液。
- 对分离的细胞进行固定和染色处理，以便后续的显微镜检查和流式细胞术分析。
流式细胞术设置：
- 使用Beckman Coulter MoFlo XDP细胞分选仪进行实验，配备有150μm喷嘴，鞘液压力为6 psi。
- 在前向散射（FSC）检测器前插入中性密度（ND）滤光片，降低信号强度，从而将动态FSC范围向左移动。
- 提高FSC检测阈值，限制小型事件的检测，增强对大型事件如脂肪细胞的检测效率。
- 使用管内搅拌系统（如SmartSampler系统），避免脂肪细胞因浮力而聚集。
实验验证：
- 使用AdTomato小鼠模型验证流式细胞术方法的有效性。AdTomato小鼠在Tamoxifen（TMX）处理后表达荧光tdTomato蛋白的所有脂肪细胞。
- 通过显微镜和流式细胞术分析确定tdTomato+事件代表成熟脂肪细胞，并重新测试最常用的亲脂性染料的染色模式。
数据分析：
- 使用FlowJo软件进行数据采集和分析，基于面积值绘制图表。
- 设置阳性门控，确保每个样本类型和染料的门控包含少于1%的未染色样本事件。
主要结果
优化的流式细胞术设置：
- 研究表明，传统的流式细胞术设置无法检测到大多数白色脂肪细胞，而新设置可以有效识别和分选白色脂肪细胞。
- 新设置包括使用大口径喷嘴（150μm直径）、降低鞘液压力至6 psi，并提高对大事件的检测效率。
- 管内搅拌系统的使用显著提高了脂肪细胞的检测效率。
验证分选效果：
- 通过显微镜检查，确认分选出的固定细胞中有约40%保持完整。
- 分选的事件位于脂肪细胞门外仅产生细胞碎片，无完整脂肪细胞，再次证实螺旋形事件不是白色脂肪细胞。
- 测量分选的小鼠scWAT和gWAT脂肪细胞的平均直径分别为38±6 μm和56±8 μm，与未分选样本的平均直径相似，表明分选过程中没有明显的偏差。
应用实例：
- 基于SSC参数，分选小或大的白色脂肪细胞，结果显示SSC_high（小）和SSC_low（大）群体在测量的平均细胞直径上有显著差异。
- 表达分析显示，较大的细胞（SSC_low）缺乏UCP1表达，而瘦素（leptin）和THBD表达较高，表明可以通过SSC实现大小依赖的转录分析。
人类脂肪细胞的β2-肾上腺素受体表达：
- 使用流式细胞术分析人类腹部皮下和网膜脂肪细胞中β2-肾上腺素受体（ADRB2）表达。
- 结果显示，两部位之间ADRB2表达无显著差异，但随着患者胰岛素水平升高，表达ADRB2的脂肪细胞百分比从近100%降至<50%。
结论和意义
本研究提供了关键的技术见解，用于分析和分选小鼠和人类脂肪细胞，并展示了该方法在研究小鼠和人类脂肪组织中UCP1和肾上腺素能受体表达的应用。脂肪细胞流式细胞术将极大地促进对脂肪细胞分子和细胞生物学的更好理解，有助于改进对调节肥胖和代谢疾病的机制的理解。
研究亮点
重要发现：
- 开发了一种详细的流式细胞术方法，用于分析和分选新鲜分离的小鼠和人类脂肪细胞。
- 验证了新的流式细胞术设置能够有效检测和分选白色脂肪细胞。
方法创新：
- 使用AdTomato小鼠模型验证流式细胞术方法的有效性。
- 引入了中性密度滤光片和高FSC阈值，解决了传统方法无法检测大多数白色脂肪细胞的问题。
特殊性：
- 研究对象包括小鼠和人类的白色、棕色和米色脂肪细胞，涵盖了广泛的脂肪细胞类型。
其他有价值内容
- 研究还探讨了亲脂性染料在脂肪细胞染色中的应用，强调了在使用细胞染料分析脂肪细胞时应谨慎。
- 通过免疫细胞化学结合流式细胞术，实现了高通量分选纯棕色或米色脂肪细胞群体，并检测了内源性脂肪细胞亚群。