本文是一篇发表于*Nano Research*期刊2026年第19卷的综述文章，题为“Functionalized Protein Nanopores: Strategies and Applications”。第一作者是Ke Sun，通讯作者为Jia Geng (四川大学)、Shengli Zhang (上海交通大学) 和 Yuan Ju (四川大学)。文章旨在系统性地总结和梳理功能化蛋白质纳米孔领域的最新进展，特别聚焦于各类工程化策略及其在单分子传感与测序等应用中的角色，并展望未来的挑战与机遇。

纳米孔技术受库尔特计数器的启发，历经三十余年发展，已从DNA测序的蓝图演变为成熟商业化的设备。其核心原理是：在偏置电压下，单个分析物进入纳米孔，改变通过孔道的离子流，产生随时间变化的离子电流记录。通过分析电流波动的幅度、偏差、持续时间和频率等特征，即可在单分子水平上对DNA、RNA、肽段、蛋白质及小分子等进行表征。蛋白质纳米孔由多个亚基在脂双层或合成嵌段共聚物膜中自组装形成，具有原子级精确的纳米或亚纳米尺寸，为识别尺寸相当的生物分子提供了可能。与固态纳米孔相比，虽然蛋白质纳米孔的操作环境要求更严格，但其尺寸精准且易于通过遗传或化学方法进行广泛修饰，这为其功能化改造提供了巨大空间。本综述的核心论点是：通过对蛋白质纳米孔进行各种功能化改造，可以极大扩展其检测能力，而定制化的计算设计有望将纳米孔功能化与应用推向前所未有的灵活性。

主要观点一：蛋白质纳米孔的功能化工程策略多种多样，主要可分为七大类。 这些策略构成了功能化纳米孔工具箱的核心，文章对每类策略的原理、方法、优缺点及典型应用进行了详尽阐述。 1. 定点诱变：这是最常用、最直接的策略。通过替换孔道内特定位置的氨基酸残基，可以调控纳米孔的几何形状、电荷分布和化学性质。其应用目标包括：*增强传感分辨率*（例如，在孔道传感区引入带正电的精氨酸或赖氨酸以增强与负电分析物的静电相互作用，延长停留时间；引入中性氨基酸以消除静电壁垒，提高信噪比；引入芳香族氨基酸以利用π-π堆积作用；引入半胱氨酸以提供化学反应位点）、*提高捕获频率*（例如，改变孔道入口处的静电性质以优化电渗流，从而促进分析物的捕获）、*控制纳米孔结构*（例如，通过突变稳定纳米孔的开放状态，减少基线噪声和门控行为；或改变亚基-脂质界面以调控寡聚体组成）、*构建异质纳米孔*（通过共表达不同突变亚基并纯化，获得具有非对称化学环境的异质孔，实现单一位点分辨率的高端传感）。 2. 非天然氨基酸修饰：通过在蛋白质序列中引入带有独特官能团的非天然氨基酸，可以极大地扩展纳米孔的化学多样性。主要方法包括体外转录翻译、遗传密码子拓展和天然化学连接法。例如，将硒代半胱氨酸引入α-溶血素纳米孔可作为纳米反应器捕捉催化反应的瞬态中间体；将带有叠氮或炔基的非天然氨基酸引入孔道，便于后续进行点击化学修饰。尽管该方法目前效率较低、成本较高，但其潜力巨大。 3. 主客体化学：将环状主体分子（如β-环糊精、γ-环糊精、葫芦脲、柱芳烃等）非共价或共价结合到纳米孔腔内，利用主体分子与分析物之间的特异性主客体相互作用进行传感。这是早期纳米孔传感的经典策略，广泛应用于核苷酸、小分子、神经毒剂水解产物等的检测以及手性分子的区分。共价固定环糊精适配体有助于实现连续、稳定的核苷酸读取。 4. 化学修饰：在通过定点诱变引入的活性位点（主要是半胱氨酸）上进行共价化学反应，连接具有特定识别功能的化学基团。这是实现对小分子，特别是手性分子或具有特定反应官能团分子高特异性检测的关键策略。常见反应包括迈克尔加成和点击化学。例如，在孔道内引入苯硼酸基团可用于检测所有含邻二醇结构的分子（如糖类、核苷）；引入氮川三乙酸基团并螯合镍离子后，可用于识别所有20种天然氨基酸，为蛋白质测序提供了概念验证。此外，引入光活性基团（如偶氮苯、光笼分子）可以实现对纳米孔电导或组装的远程光控。 5. 截断修饰：通过删除纳米孔蛋白的特定结构域（如柔性环或末端序列），可以改变孔径、提高稳定性或消除门控噪声。例如，截除FhuA纳米孔的“软木塞”结构域和部分环区，可获得稳定开放状态的大孔径纳米孔，用于研究蛋白质-核酸相互作用。截断修饰是一种有效的“减法”工程策略。 6. 外部探针修饰：在纳米孔入口处通过化学或遗传方法连接“诱饵”分子（如DNA适配体、肽段、抗体、纳米抗体、蛋白质受体等），利用其特异性结合能力将目标分析物捕获至孔口附近，进而通过产生的特征电流信号进行检测和定量。这一策略将纳米孔的检测范围从基于尺寸排阻的传感拓展到了基于特异性分子识别的传感，适用于蛋白质生物标志物、酶活性乃至激酶抑制剂的检测。 7. 重新设计：通过计算设计和定制，对纳米孔进行模块化改造或从头设计，以创造具有全新功能的结构。这是最具前瞻性的策略。例子包括：构建融合蛋白（如将α-溶血素与分子伴侣GroES的环融合，用于研究伴侣蛋白系统）；创建双缩窄结构纳米孔（如CsgG-CsgF嵌合孔，可提高同聚物DNA区域的测序准确率）；以及最引人注目的“自下而上”构建分子机器（如将蛋白酶体、激活剂和跨膜β桶结构域组装成“蛋白酶体-纳米孔”，结合解折叠酶，实现了对蛋白质的“切-落”和“穿-读”两种分析模式），为真正的单分子蛋白质测序奠定了基础。

主要观点二：功能化策略与目标应用紧密关联，不同的应用场景驱动着特定工程策略的发展。 文章并非简单罗列方法，而是始终从应用导向的视角阐明各种策略的设计逻辑。 * 对于DNA/RNA测序：核心需求是提高单个核苷酸的分辨率和信噪比，并控制易位速度。因此，在MspA纳米孔传感区引入中性天冬酰胺突变以消除电荷干扰，或设计CsgG-CsgF双缩窄孔以调制电信号，是代表性的策略。结合外部马达蛋白（如解旋酶、聚合酶）控制易位速度的单分子皮米级纳米孔镊子技术，更是实现了超高精度的DNA测序和损伤检测。 * 对于肽段和蛋白质分析：目标是识别氨基酸序列、翻译后修饰以及研究蛋白质构象。策略更加多样化。Aerolysin (Ael) 和Cytolysin A (ClyA) 等具有较长管腔的纳米孔被广泛用于肽段传感。通过引入带电或芳香族氨基酸延长肽段停留时间；通过调控电渗流与电泳力的平衡来优化捕获；通过化学修饰（如MspA-NTA）实现单个氨基酸的识别；通过截断获得大孔径ClyA-AS变体来捕获并研究完整蛋白质的构象动力学。 * 对于小分子检测：需要引入高选择性的识别位点。主客体化学（如环糊精适配体）和化学修饰（如引入苯硼酸、金属螯合基团）是主要手段。这些策略使得纳米孔能够区分手性异构体、检测神经递质、糖类、金属离子等。 * 对于单分子化学研究：目标是将纳米孔转变为“纳米反应器”，实时观察化学反应动力学。关键策略是在传感区精确引入活性残基（如半胱氨酸），并利用其进行定点化学修饰或直接作为反应位点，从而在限域空间内监测二硫键交换、配位反应等过程。

主要观点三：尽管取得了显著进展，但蛋白质纳米孔领域仍面临挑战，未来发展方向明确。 文章在结论与展望部分指出，当前可检测的分析物范围仍然有限。未来的发展将依赖于对现有纳米孔的进一步优化以及对新型纳米孔的发掘。重要方向包括： 1. 扩大化学多样性：更多地利用非天然氨基酸修饰和先进的生物正交化学，为纳米孔引入更丰富的化学功能基团。 2. 计算设计与从头设计：借助人工智能和蛋白质设计领域的进步，计算驱动的纳米孔重新设计和从头设计（de novo design）将发挥越来越重要的作用，能够创造出具有定制化性能的全新孔道，例如用于蛋白质测序的专用纳米孔。 3. 发现新型天然纳米孔：不断从自然界中挖掘具有独特性质（如机械敏感性、内在酶活性）的新型膜蛋白，拓宽纳米孔的工具箱。 4. 攻克单分子蛋白质测序：这是该领域的终极挑战之一。整合了蛋白酶体、解折叠酶和纳米孔的“分子机器”展示了可行的技术路径，但实现单氨基酸分辨率仍需在孔道设计、信号解读和易位控制方面取得突破。

本文的学术价值与意义：本文不仅仅是一篇技术方法的汇编，更是一份从基础原理到前沿应用、从经典策略到未来蓝图的系统性指南。它清晰地阐述了功能化策略背后的物理化学原理（如静电相互作用、空间位阻、主客体化学、限域效应）与具体应用目标之间的内在联系，为研究人员选择或设计合适的纳米孔工程方案提供了清晰的概念框架和理论指导。文章特别强调了跨学科融合（合成生物学、计算化学、单分子生物物理）对推动该领域发展的关键作用。通过对现有成就的总结和对未来挑战的剖析，本文不仅服务于领域内的研究者，也为有意进入该领域的新科学家描绘了一幅全面的发展图景，对推动纳米孔技术在生物传感、诊断、测序和基础科学研究中的创新应用具有重要的参考价值。