学术报告

作者与研究机构以及发表情况

本文的主要作者包括 Samagya Banskota、Aditya Raguram、Susie Suh 等，通讯作者为 David R. Liu（邮箱：drliu@fas.harvard.edu），研究所在 Broad Institute of MIT and Harvard、Harvard University、University of California, Irvine 等多家机构。该研究发表于 《Cell》 期刊第185卷（2022年1月20日），文章标题为 《Engineered Virus-like Particles for Efficient In Vivo Delivery of Therapeutic Proteins》，文章为开放获取（Open Access）形式。

研究背景

近年来，基因编辑技术的发展，使得精确调控生物体基因组 DNA 的可能性成为现实，这为治疗许多遗传疾病提供了前所未有的机会。作为基因编辑工具的重要组成部分，碱基编辑器（Base Editors，BEs）在不产生双链断裂的条件下实现单碱基编辑，以减小不良编辑如插入/删除突变（indels）等问题。现有的基因组编辑技术多基于病毒载体（如腺相关病毒 AAV）递送编辑剂，但这些方法存在 DNA 整合到宿主基因组的风险以及编辑剂长期表达的不良影响。因此，本文提出一种新型的解决方案：通过设计和改造的病毒样粒子（Engineered Virus-like Particles，EVLPs），用于安全、高效的基因编辑蛋白质体内递送。

研究的核心目的是优化 EVLP 的设计与递送效率，开发一种既避免 DNA 整合，又能支持多组织和器官范围内治疗基因编辑的工具。

研究流程和实验设计

该研究分多个阶段展开，通过系统的工程设计解决现有病毒样粒子（VLPs）在基因编辑应用中的三大瓶颈问题：货物包装、释放效率以及递送靶向性。

第一阶段：建立初代 VLP 平台

研究最先以 Friend-Murine Leukemia Virus（FMLV）为平台，将腺嘌呤碱基编辑器 ABE8e 融合到病毒 Gag 蛋白末端以实现初步货物装载。随后在生产细胞（HEK293T）中过表达 Gag-ABE8e、野生型 Gag-Pro-Pol 蛋白及 VSV-G 信使 RNA，并对生成的 VLP 进行体外验证。结果表明，初代 VLPs（V1 BE-VLPs）在 HEK293T 细胞中能有效实现靶向位点的单碱基编辑，但限于 FMLV 的分子设计，货物释放效率及编辑效能仍有改进空间。

第二阶段：优化货物释放（开发第二代 VLP，V2 BE-VLPs）

作者假设，Gag 与 ABE8e 之间的连接肽（Linker）作为蛋白酶（Protease）切割位点，其切割效率可能为货物释放的瓶颈。为验证此假设，研究尝试了不同的连接肽序列，同时将 FMLV 替换为 Moloney-Murine Leukemia Virus（MMLV）作为模板。实验结果验证了特定序列更高效的切割能力，最终确定优化的 V2 BE-VLP 架构（V2.4），其在体外测试中相较 V1 提升了 1.2-1.5 倍编辑效率。

第三阶段：优化生产细胞中的 VLP 货物定位（第三代 VLP，V3 BE-VLPs）

作者进一步假设，ABE8e 上的双核定位信号（NLS）会限制融合蛋白在生产细胞质膜处的定位，从而影响 VLP 中货物装载的效率。研究者通过在 Gag 蛋白上加入多个核输出信号（NES），同时调整切割连接肽的位置，开发出 V3 BE-VLP，其中 V3.4 结构展现了最佳货物本地化和编辑效率，相较 V2.4 在体外测试中提高了 2.1 倍。

第四阶段：调整组件比例以优化装载容量（开发第四代 VLP，V4 BE-VLPs）

为了提高货物装载量与总颗粒产量平衡，团队对 Gag-Cargo 和 Gag-Pro-Pol 的比例进行了多个实验调整。最终优化得到的 V4 BE-VLP，与初代相比，货物蛋白装载量提高了 16 倍，同时显著增强了编辑效率（>8 倍）。

动物实验验证

1. 肝脏疗效验证
   通过尾静脉注射，V4 BE-VLP 被递送到小鼠肝脏，针对 PCSK9 基因的治疗性编辑得到了 63% 的编辑效率。在血清 PCSK9 水平测量中，相较未经治疗的对照组减少了 78%。

2. 基因敲除在中枢神经系统的应用
   对出生后的小鼠进行了脑室内注射（ICV），V4 BE-VLP 在大脑皮层和中脑显示了>50%的高效编辑，打开了无病毒基因编辑应用于中枢神经系统的可能性。

3. 治疗遗传性失明模型
   在 Leber’s Congenital Amaurosis（LCA）小鼠模型中，V4 BE-VLP 亚网膜注射部分修正 RPE65 突变，恢复了视网膜细胞功能，且无显著毒副作用。

主要结果

• 编辑效率：V4 BE-VLP 平台可在 HEK293T 细胞、原代人类和小鼠细胞中实现超过 95% 的基因编辑效率。
• 体内验证：在小鼠模型肝脏和眼部基因疗法中表现出与当前最先进递送系统（如 AAV 和 LNP）相当甚至更优的疗效。
• 特异性：与 DNA 和 mRNA 递送相比，VLP 的基因整合风险极低，体内外脱靶编辑明显减少。
• 毒性评估：动物实验中，肝功能正常，无组织学毒性。

结论与意义

这项研究通过精巧的病毒样粒子 VLP 工程，为碱基编辑器的递送提供了一个安全、有效且可扩展的解决方案。V4 BE-VLP 平台结合了病毒递送的高效性和非病毒递送的安全性，其优越性能使其有望替代目前主流的 AAV 和 LNP 技术，未来应用领域包括遗传性疾病治疗、免疫细胞工程和其他生物医学研究场景。

亮点总结

1. 技术创新：首次通过系统工程解决 VLP 包装、释放与定位三大瓶颈。
2. 编辑效率提升：成功开发出大幅提高货物蛋白装载效能的第四代 VLP（V4 EVLP）。
3. 多组织适用性：横跨肝脏、中枢神经系统与视网膜的体内验证，展现广泛治疗潜力。
4. 安全性显著提高：实现低脱靶编辑和避免 DNA 整合。

潜在局限与展望

本文虽成功证明了 VLP 的体内应用潜力，但研究指出 VLP 中可能掺入生产细胞的非特异性蛋白和 RNA，将来的工作需进一步优化生产工艺并全面评估其免疫原性。此外，推动 VLP 平台向更复杂的疾病模型或人类临床转化仍需更深入研究。