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利用分支扩增技术检测大肠杆菌O157:H7及其他产志贺毒素大肠杆菌菌株

期刊:journal of clinical microbiologyDOI:10.1128/jcm.43.12.6086–6090.2005

这篇文档属于类型a,即报告了一项原创性研究。以下是针对该研究的学术报告:


作者与机构
本研究由Fan Li、Chunyan Zhao(吉林大学基础医学院病原生物学系)、Wandi Zhang、David Y. Zhang(美国纽约西奈山医学院病理学系)、Shenghui Cui、Jianghong Meng(美国马里兰大学营养与食品科学系)共同完成,发表于2005年12月的《Journal of Clinical Microbiology》(第43卷第12期,页码6086–6090)。


学术背景
研究领域为微生物学与分子诊断技术,聚焦于食源性致病菌——产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC)的检测。STEC(尤其是O157:H7血清型)因低感染剂量和高致病性(如引发溶血性尿毒综合征)成为公共卫生挑战。传统检测方法(如选择性培养基培养、血清学检测)存在灵敏度低或耗时长的问题,而PCR技术虽灵敏却受限于设备成本和操作复杂性。因此,本研究旨在开发一种新型等温核酸扩增技术——分支扩增(Ramification Amplification, RAM),以提升STEC检测的灵敏度、特异性及便捷性。


研究流程
1. 探针设计与靶标选择
- 针对STEC的志贺毒素2基因(stx2)设计环形探针(c-probe,124核苷酸),包含靶标互补区、连接区和通用引物结合区(表2)。
- 合成stx2基因的合成靶序列(97 bp)用于灵敏度测试。

  1. 样本制备

    • 细菌分离株:共33株,包括27株STEC(含22株O157:H7)、3株非致病性大肠杆菌和1株痢疾志贺菌(表1)。
    • 样本处理:细菌裂解采用5 M硫氰酸胍(GTC)缓冲液,煮沸后60℃过夜孵育以释放DNA。
  2. RAM检测流程

    • 杂交与捕获:c-probe和生物素化捕获探针与靶DNA杂交,通过链霉亲和素磁珠捕获复合物并洗涤去除非特异性结合。
    • 连接与扩增:Taq DNA连接酶闭合环形探针,Bst DNA聚合酶在63℃等温条件下启动分支扩增(图1)。扩增产物经EcoRI酶切后通过凝胶电泳或实时荧光(SYBR Green I)检测。
  3. 对照实验

    • 灵敏度测试:使用合成stx2靶标(10⁵至10¹拷贝)和O157:H7菌株(10⁵至10¹细胞)验证检测下限。
    • 特异性验证:对比STEC、非致病性大肠杆菌和痢疾志贺菌的RAM信号。
  4. PCR验证

    • 采用stx1/stx2特异性引物(表2)进行PCR,扩增产物为614 bp(stx1)和779 bp(stx2),与RAM结果一致性分析。

主要结果
1. 灵敏度
- RAM可检测低至10拷贝的合成stx2靶标(图2a)和10个O157:H7细菌(图2b),与PCR灵敏度相当。

  1. 特异性

    • 所有27株含stx2的STEC均为RAM阳性,而仅含stx1的菌株(如O26:H11)和非致病菌均为阴性(图3)。RAM与PCR结果一致性达100%(表1)。
  2. 实时RAM可行性

    • 加入SYBR Green I后,实时监测可在2小时内检出10个细菌,信号强度与靶标浓度正相关(图4)。

结论与价值
1. 科学意义
- RAM技术通过环形探针的靶标依赖性连接和等温扩增,实现了与PCR相当的灵敏度,且无需热循环仪,为资源有限地区的STEC检测提供新选择。

  1. 应用潜力

    • 适用于食品和临床样本的快速筛查,尤其对低载量样本(如污染食品或早期感染粪便)具有优势。
  2. 技术拓展性

    • 未来可通过设计多重c-probe(如针对stx1、hly基因)实现STEC毒力因子的同步检测。

研究亮点
1. 方法创新
- RAM结合磁珠捕获与等温扩增,简化了传统核酸扩增的步骤和设备需求。
2. 严谨验证
- 通过合成靶标、细菌稀释系列和临床分离株多维度验证性能。
3. 实时检测适配性
- 首次将SYBR Green I荧光监测引入RAM,缩短检测时间至2小时。


其他价值
- 研究获美国农业部和中国国家自然科学基金资助,体现了跨学科合作对公共卫生技术的推动作用。
- 为后续开发基于RAM的现场检测设备(如便携式荧光仪)奠定了实验基础。


(报告字数:约1500字)

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