本研究由Yage Sun、Xinrui Zhao、Rong Yang、Meng Xiao和Wenguang Liu等人完成，主要作者来自天津大学材料科学与工程学院（School of Materials Science and Engineering, Tianjin University）及中国科学院北京纳米能源与系统研究所（Beijing Institute of Nanoenergy and Nanosystems, Chinese Academy of Sciences）。该论文以研究论文（research article）形式发表于《Advanced Functional Materials》期刊，在线发表日期为2024年12月11日，DOI为10.1002/adfm.202412633。
一、研究背景与目的
癫痫（epilepsy）是全球最常见的神经系统疾病之一，影响约1%的人口。其病理基础在于神经元兴奋性异常升高，导致脑内兴奋性与抑制性神经递质分泌失衡。目前临床上广泛使用的抗癫痫药物（anti-epilepsy drugs, AEDs）如苯妥英（phenytoin, PHT）通过阻断电压门控钠通道发挥抗癫痫作用，但存在血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）通透性低、高剂量毒副作用以及难以调控病灶微环境等问题。更为关键的是，癫痫发作伴随的氧化应激和炎症反应会形成“炎症-癫痫发生”恶性循环，AEDs仅能缓解症状，无法改善病灶微环境或阻断疾病进展。此外，癫痫病灶的缺氧微环境会激活缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）—ABCB1信号轴，导致P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）过表达，该蛋白作为药物外排泵加速AEDs外排，进一步降低治疗效果。基于上述问题，本研究旨在构建一种兼具跨BBB递送和微环境调控功能的纳米酶（nanozyme），以实现对急性癫痫的综合治疗。
二、研究设计与工作流程
该研究的核心策略是设计并制备一种基于α-硫辛酸（α-lipoic acid, LA）的纳米酶，负载PHT并络合钙离子（Ca²⁺），形成LA@PHT-Ca²⁺纳米颗粒。研究流程可分为材料制备与表征、体外功能验证、BBB穿透能力评估、体内治疗效果评价四个主要阶段。
在材料制备方面，研究者利用LA的两亲性（亲水羧基与疏水五元杂环）通过自组装和紫外光引发的开环聚合制备LA纳米颗粒。具体步骤为：将LA溶解于丙酮后滴入去离子水中形成纳米聚集体，去除丙酮后在365 nm紫外光下引发二硫键动态交换聚合，形成稳定的线型共价网络。PHT与LA共溶于丙酮实现负载，Ca²⁺通过与羧基配位络合到纳米颗粒表面。最终获得的LA@PHT-Ca²⁺粒径约为95 nm，Zeta电位为-8.7 mV，PHT载药量为14.42%，包封率为63.84%。研究使用了动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）、能量色散光谱（EDS）等手段对纳米颗粒进行表征。此外，研究中还使用Cy5.5荧光标记用于追踪纳米颗粒的细胞摄取和体内分布。这些方法均为该领域常规技术，但将LA本身作为纳米酶载体并利用其内源性SMVT转运特性实现跨BBB递送是本研究的重要创新。
体外功能验证包括细胞摄取、自由基清除、神经元保护及Ca²⁺对缺氧微环境的调控等实验。细胞模型选择小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3（BBB主要组成细胞）和小鼠海马神经元细胞HT22。实验样本量在各功能实验中通常为每组3个重复（n=3）。细胞摄取实验表明LA纳米颗粒和LA@PHT-Ca²⁺可被两种细胞有效内化，且负电荷表面未阻碍摄取。自由基清除实验包括DPPH、ABTS、超氧阴离子（O₂⁻·）和羟自由基（OH·）的清除实验，以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性检测、过氧化物酶（peroxidase, POD）活性检测和电子顺磁共振（electron paramagnetic resonance, EPR）分析。结果显示LA@PHT-Ca²⁺通过SOD样和POD样级联反应以及氧化还原反应将O₂⁻·转化为H₂O₂并进一步转化为H₂O，展现出“全能抗氧化”能力。在神经元保护实验中，HT22细胞经800 μM H₂O₂处理建立氧化应激模型，细胞活力由60%恢复至约80%，SOD活性提高，丙二醛（malondialdehyde, MDA）水平降低，活性氧（reactive oxygen species, ROS）荧光信号减弱。Ca²⁺功能验证中，采用CoCl₂模拟缺氧条件处理HT22细胞（400 μM），结果显示LA@PHT-Ca²⁺降低细胞内ATP水平，下调HIF1-α和ABCB1基因表达，并抑制P-gp蛋白的免疫荧光强度，证实Ca²⁺通过干扰线粒体氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）减少ATP生成、改善缺氧微环境并抑制药物外排。
BBB穿透能力评估分为体外和体内两部分。体外实验采用Transwell系统，将bEnd.3细胞接种于上室培养7天形成单层（跨内皮电阻达到约200 Ω·cm²），下室培养HT22细胞。Cy5.5标记的纳米颗粒加入上室后，通过激光共聚焦显微镜观察其在上层细胞内的摄取、外排及进入下室的过程。结果显示纳米颗粒在2小时内被bEnd.3细胞内化，2–4小时发生外排，6小时内进入下室并被HT22细胞摄取。在模拟氧化应激的下室HT22细胞中，纳米酶加入上室后仍能降低下室细胞内的ROS，进一步证实其跨BBB后的功能活性。体内实验采用正常大鼠和氯化锂-匹罗卡品诱导的癫痫模型大鼠，通过尾静脉注射Cy5.5标记纳米颗粒，在不同时间点（1、2、4小时）取脑组织进行IVIS荧光成像。结果显示模型组脑内荧光强度显著高于对照组，2小时达峰值，表明癫痫状态下SMVT介导的转运增强。脑组织冰冻切片进一步证实纳米颗粒在海马区的分布。
体内治疗效果评价中，30只雄性SD大鼠随机分为6组（对照组、模型组、PHT组、LA纳米颗粒组、LA@PHT组和LA@PHT-Ca²⁺组），每组5只。急性癫痫模型采用氯化锂-匹罗卡品点燃法建立。各组在造模前连续3天经尾静脉给予相应药物或纳米颗粒（PHT等效剂量为5 mg/kg）。造模后1小时内记录癫痫发作潜伏期、持续时间和发作次数，并根据Racine评分标准进行症状评分。同时植入电极进行实时脑电图（electroencephalogram, EEG）记录。造模后24小时进行旷场实验评估运动活性和焦虑行为。造模后第3天取脑组织进行尼氏染色（Nissl staining）、NeuN免疫荧光染色、c-Fos、GFAP、Iba-1、TUNEL及HIF1-α免疫荧光染色。此外，在给药后6小时处死部分大鼠取海马组织，通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）检测PHT浓度。
三、主要研究结果
行为学结果显示，模型组在20分钟内即出现癫痫发作，平均发作持续约200秒，60分钟内发作频率达10–15次，Racine评分最终达5分。LA@PHT-Ca²⁺组发作潜伏期延长至35分钟，发作持续时间缩短至33秒，60分钟内发作次数少于5次，Racine评分降至约3分，表明该纳米酶能有效延迟癫痫发作、缩短发作持续时间并降低发作频率。EEG记录显示LA@PHT-Ca²⁺组局部场电位降低，神经元兴奋性受到抑制。旷场实验中，LA@PHT-Ca²⁺组大鼠总运动距离、进入中央区次数和中央区运动距离均较模型组显著增加，说明其改善了癫痫后的焦虑样行为。
组织学分析显示，模型组海马CA3区神经元数量明显减少，尼氏染色和NeuN染色均表现为神经元丢失和变性。LA@PHT-Ca²⁺组神经元数量恢复至正常水平。c-Fos蛋白表达在模型组显著升高，而LA@PHT-Ca²⁺组恢复至正常水平，表明神经元由激活状态转为静息状态。GFAP和Iba-1免疫荧光显示LA@PHT-Ca²⁺组星形胶质细胞和小胶质细胞活化程度降低，炎症微环境得到改善。HIF1-α表达在LA@PHT-Ca²⁺组显著下调，证实缺氧微环境得到改善。TUNEL染色显示神经元凋亡减少。LC-MS检测显示LA@PHT-Ca²⁺组海马区PHT浓度显著高于游离PHT组和LA@PHT组，证实Ca²⁺介导的P-gp抑制延长了PHT在病灶部位的滞留时间。
四、研究结论与意义
本研究成功设计并构建了一种基于α-硫辛酸的纳米酶LA@PHT-Ca²⁺，该纳米酶兼具跨血脑屏障递送、抗氧化应激和微环境调控三重功能。LA作为维生素B类辅酶，通过钠依赖性多维生素转运体（sodium-dependent multivitamin transporter, SMVT）实现跨BBB递送；其酶样活性和还原性提供了级联自由基清除能力，保护神经元免受氧化损伤；Ca²⁺通过干扰线粒体氧化磷酸化减少ATP生成，抑制P-gp表达，延长PHT在病灶内的滞留时间。在急性癫痫大鼠模型中，LA@PHT-Ca²⁺显著减轻癫痫发作症状，改善神经元存活和炎症微环境，打破了“炎症-癫痫发生”恶性循环。该研究为癫痫的综合性治疗提供了一种新的纳米药物策略，具有重要的科学价值和临床转化潜力。
五、研究亮点与创新性
本研究的创新性主要体现在以下几个方面：首先，首次利用LA本身作为纳米载体构建纳米酶，摒弃了传统金属基纳米酶生物相容性差的问题，且LA作为内源性辅酶具有天然跨BBB能力，避免了复杂的配体修饰。其次，将Ca²⁺引入纳米系统用于调控缺氧微环境和药物外排是本研究的重要创新，通过干扰线粒体OXPHOS抑制ATP依赖性P-gp介导的药物外排，从能量代谢角度提高药物滞留。第三，LA@PHT-Ca²⁺实现了抗氧化、抗炎和抗癫痫药物递送的多功能协同，打破了单纯症状控制的局限。此外，研究通过体外Transwell模型、细胞内氧化应激模型、体内IVIS成像和行为学、组织学等多层次验证，形成了从材料设计到功能验证再到体内疗效的完整证据链。这些工作为纳米酶在神经系统疾病治疗中的应用提供了新的思路。