本研究由Ashley R. Murphy、Rose Ann Franco和Mark C. Allenby（通讯作者，电子邮箱：m.allenby@uq.edu.au）完成，他们均来自澳大利亚昆士兰大学化学工程学院。该研究于2025年发表在期刊 Small 上，论文标题为“Fabricating microfluidic co-cultures of immortalized cell lines uncovers robust design principles for the simultaneous formation of patterned, vascularized, and stem cell-derived adipose tissue”。
本研究属于组织工程与微流控生物制造领域的原创性研究。研究背景是：体外共培养过程若能在支持实质组织向成熟分化的同时形成血管网络，将具有众多临床和农业应用价值，但由于血管内皮细胞与实质细胞（如脂肪细胞）的培养条件常常相互冲突，这一目标一直难以实现。特别是，实验室培育的血管化脂肪组织可用于研究糖尿病、肥胖、代谢综合征和心血管疾病，并可用于推进培育肉技术。然而，传统二维培养无法模拟体内血管与实质组织之间复杂的旁分泌信号和营养梯度，导致无法在体外可重复地构建血管化的实质组织。已有三维共培养模型需要多步分化流程，不能在形成微血管网络的同时支持脂肪组织分化。因此，本研究旨在利用微流控三维水凝胶培养装置，产生血管生成因子和脂肪生成因子的逆流梯度，探索在不朽化人源内皮细胞和间充质干细胞共培养体系中同时形成微血管网络和干细胞来源脂肪组织的设计原则。
研究的工作流程包括多个层次。首先，研究者在二维培养条件下系统优化了绿色荧光蛋白标记的人端粒酶逆转录酶（hTERT）永生化人主动脉内皮细胞（GFP-HAECs）与人端粒酶逆转录酶永生化人脂肪来源间充质干细胞（HAd-MSCs）的共培养接种比例。细胞以总密度187500细胞/cm²接种于未包被的组织培养聚苯乙烯表面，接种比例分别为2:1、1:1、1:2、1:5和1:10，在完全血管细胞培养基中培养7天，并通过时间推移显微镜结合图像分析定量评估血管网络的连接点数量、端点数量、总血管长度和总血管面积。同时，研究还进行了免疫细胞化学染色，检测CD31、αSMA、CD90和F-actin等表型标志物。第二步，研究者将这些条件转化为三维纤维蛋白水凝胶微流控培养。在已验证的微流控装置中，将GFP-HAECs和HAd-MSCs以5:1、2:1、1:1和1:2的比例包埋于纤维蛋白水凝胶中，总细胞密度为13×10⁶细胞/mL，培养7天，同样通过时间推移显微镜和图像分析以及免疫染色评估血管网络形态和通畅性。第三步，研究者将双通道微流控装置改造为四通道装置，用于在培养室两端分别灌注血管生成培养基和脂肪生成培养基，从而形成逆流的生长因子梯度。研究通过数值模拟预测了胰岛素样生长因子1（IGF-1）、血管内皮生长因子（VEGF）、酸性成纤维细胞生长因子（FGF-α）、表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（FGF-β）、地塞米松和胰岛素等因子的扩散-衰减分布，并根据EC50判断生物活性浓度的覆盖范围。随后，在梯度培养条件下，将GFP-HAECs和HAd-MSCs以0:1、1:2、1:1和2:1的比例共培养17天，然后在第17天反转培养基梯度再培养至31天，以同时支持血管网络形成和脂肪分化。最后，研究者在共培养体系中分别加入1 μM亚精胺和50 nM VO-OHpic（一种PTEN抑制剂），持续31天，以检测这些已知可诱导脂解的小分子是否能调控该人源体外模型中的脂质生成。
研究的主要结果显示，在二维培养中，2:1和1:1比例分别在22小时和82小时左右发生培养物整层脱离，而1:2、1:5和1:10比例形成了稳定且持续贴壁的血管网络。1:5比例在保持非增大连接点和网络连续性的同时表现出最大的网络密度，因此被确定为二维血管生成的最佳接种比例。时间推移分析表明，所有比例在接种后约12小时达到连接点、端点、血管长度和面积的最大值，随后下降，约在第4天稳定。在1:10比例中，第4天后观察到血管生成样出芽，表现为所有血管指标的再次上升。免疫染色显示CD31特异性定位于血管样结构，尤其在细胞间连接处；αSMA阳性细胞包绕血管外侧并形成桥接结构；CD90阳性细胞分布于培养板底部。在三维纤维蛋白水凝胶培养中，总血管长度、连接点数和端点数随着GFP-HAEC:HAd-MSC比例从5:1降至1:2而增加，但总血管面积反而下降。1:1比例形成了具有最大长度、连接点和端点数且无网络断裂的连续血管网络，因此被确定为三维血管生成的最佳比例。时间推移分析同样显示出约12小时达到峰值、随后下降并在第4天稳定的趋势。共聚焦显微镜证实了血管腔通畅，平均腔径为9.76±2.11 μm。值得注意的是，在无HAd-MSCs的情况下，内皮细胞仍可在三维水凝胶中自组装，但网络存在断裂且边界粗糙；在无内皮生长因子补充的基础培养基中，共培养仍形成连续血管网络，但平均直径（19.1±3.72 μm）小于对照组（34.22±1.79 μm）。这些结果提示三维纤维蛋白水凝胶的力学和生化特性对血管网络具有稳定作用。
在梯度共培养实验中，数值模拟显示血管生成因子IGF-1最大分布距离为2.6 mm，VEGF为3.1 mm，而脂肪生成因子如地塞米松为4.7 mm，胰岛素可覆盖整个7.9 mm培养室。实验中，经过17天和31天培养后，在GFP-HAEC和HAd-MSC共培养的各个比例（1:2、1:1和2:1）中均观察到球形脂滴样结构，而在HAd-MSC单培养（0:1）中几乎无脂滴形成。脂质覆盖率定量分析显示，1:2、1:1和2:1共培养分别为67.4%、62.67%和56.1%，而单培养仅为1.86%。这一结果表明微血管网络显著增强了HAd-MSC的成脂分化。脂质在培养室内的空间分布分析显示，在第17天时，1:1共培养条件中脂肪生成侧与血管生成侧的脂质覆盖率存在显著差异，第31天时1:1和2:1条件仍存在显著差异，而单培养无显著空间差异。免疫细胞化学检测在共培养第17天检测到过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARg）的表达。在添加1 μM亚精胺或50 nM VO-OHpic后，共培养的脂质覆盖率分别为85.9%和87.9%，与对照（85.9%）相比无显著差异，单培养各条件也无差异。这表明这两种已知在小鼠模型中可诱导脂解或抑制PTEN的分子在该新型人源体外血管化脂肪组织模型中无效。
本研究的结论是：通过使用hTERT永生化的人主动脉内皮细胞和脂肪来源间充质干细胞，可以在二维培养（1:5比例）和三维纤维蛋白水凝胶培养（1:1比例）中以高可重复性形成稳健的微血管网络。微流控逆流梯度培养可在同一三维空间中同时实现微血管网络形成和脂肪细胞分化，且血管网络可显著增强脂肪生成，达到了无血管培养无法实现的脂质覆盖率。该研究首次报道了在31天梯度培养中同时形成整合的微血管网络和产脂脂肪细胞的条件。其科学价值在于揭示了血管-脂肪相互作用在体外模型中的关键作用，提供了一种可重复的人源临床前模型，用于研究糖尿病、肥胖和代谢综合征等疾病中的血管-脂肪串扰。其应用价值在于该平台可支持生物治疗筛选和培育肉技术开发。
本研究的主要亮点包括：第一，首次系统性优化了GFP-HAEC和HAd-MSC这对永生化细胞系在二维和三维条件下的血管生成接种比例，并利用时间推移显微镜揭示了血管形态发生的三个阶段（早期离散结构形成、吻合形成连续网络、成熟稳定）；第二，通过四通道微流控装置实现了血管生成和脂肪生成因子的逆流梯度，并利用数值模拟指导培养设计；第三，证明了微血管网络对HAd-MSC成脂分化的显著增强作用，并提示人源模型与小鼠模型在血管介导脂解机制上可能存在物种差异。