海洋双壳类生物活性肽的筛选与抗菌特性研究

作者及机构
本研究由印度Anna University的Arputha Bibiana、Subbiah Latha、Selvamani Palanisamy团队与Nandha College of Pharmacy的Thangavelu Prabha合作完成，发表于2020年1月的*International Journal of Peptide Research and Therapeutics*（DOI: 10.1007/s10989-020-10027-5）。

学术背景
抗生素耐药性日益威胁全球公共卫生，亟需开发新型抗菌药物。海洋生物（尤其是软体动物）因其独特的代谢产物成为潜在药物来源。本研究聚焦两种未被充分研究的双壳类——楔形斧蛤（*Donax cuneatus*）和红蛤（*Pitar erycina*），旨在从其组织中分离具有抗菌活性的生物活性肽（Antimicrobial Peptides, AMPs），并通过质谱指纹图谱（MALDI-TOF-MS）技术进行鉴定。

研究流程
1. 样本采集与粗蛋白提取
- 对象：从印度泰米尔纳德邦海岸采集的两种双壳类，经形态学鉴定后提取全组织蛋白。
- 方法：比较酸性提取（5%乙酸）、磷酸盐缓冲液（pH 4.0/7.²⁄₉.0）及Tris缓冲液（pH 4.⁶⁄₇.²⁄₉.0）的蛋白得率。酸性提取法获得最高产量（楔形斧蛤1.0 mg/mL，红蛤0.9 mg/mL），后续实验基于此优化。

1. 提取工艺统计优化

   • 响应面法（RSM）：以固液比（A）、温度（B）、均质时间（C）为变量，通过中心复合设计（CCD）建立二次多项式模型。最优条件为固液比13.36 g/mL、温度26.63°C、均质时间18.36分钟，预测肽浓度17.32 mg/mL，实验验证值为16.54 mg/mL。
     

2. 肽的纯化与活性筛选

   • 柱层析：DEAE纤维素柱分离粗肽，线性NaCl梯度（0–0.5 M）洗脱，楔形斧蛤得6个组分，红蛤得9个组分。
     
   • RP-HPLC：组分3A（楔形斧蛤）和5B（红蛤）显示最强抗菌活性，保留时间分别为9.191分钟和9.851分钟。
     

3. 抗菌活性评估

   • 测试菌株：包括变形杆菌（*Proteus vulgaris*）、肺炎克雷伯菌（*Klebsiella pneumoniae*）等9种病原体。
     
   • MIC/MBC：组分3A和5B对肺炎克雷伯菌和伤寒沙门氏菌（*Salmonella typhi*）的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）均为10 μg/mL，优于氯霉素标准品（40 μg/mL）。
     
   • 时间-杀菌动力学：2×MIC浓度下，4小时内可完全抑制所有测试菌株生长。
     

4. 肽的分子特征分析

   • SDS-PAGE：组分3A和5B的分子量分别为16 kDa和23 kDa。
     
   • MALDI-TOF-MS：精确分子量为10.5 kDa（3A）和10.0 kDa（5B）。数据库比对显示，3A与海螺（*Haliotis asinina*）膜分泌蛋白相似度51%，5B与豆蚜（*Megoura viciae*）抗菌肽Megourin 2相似度87%。
     

主要结果
- 酸性提取法效率最高，且通过RSM优化后肽得率提升15%。
- 纯化组分3A和5B具有广谱抗菌活性，尤其对革兰氏阴性菌（如肺炎克雷伯菌）效果显著。
- 低浓度杀菌特性：10 μg/mL即可完全杀灭部分病原体，且耐药性风险低。

结论与价值
本研究首次从楔形斧蛤和红蛤中分离出高效抗菌肽，其分子量小、活性强，为开发新型抗生素提供了候选分子。科学价值在于揭示了海洋双壳类作为AMP来源的潜力；应用价值体现在其或可替代传统抗生素，尤其针对耐药菌感染。

研究亮点
1. 方法创新：结合RSM优化提取工艺与MALDI-TOF-MS精准鉴定，提升了肽的筛选效率。
2. 活性显著：分离的肽在极低浓度下即表现出杀菌效果，且作用速度快（4小时起效）。
3. 资源开发：首次报道两种双壳类的抗菌肽，拓展了海洋药物资源库。

其他价值
研究强调海洋无脊椎动物的免疫防御分子可作为药物开发靶点，为后续临床前研究（如毒性测试、作用机制解析）奠定了基础。