这是一份关于从巴西不同地区牛亚临床乳腺炎中分离出的葡萄球菌的分子分型及生物膜基因表达分析的研究报告。该研究发表于 Antibiotics 期刊，于2020年9月25日收稿，同年12月7日被接收，并于12月10日正式发表。研究的主要完成单位包括巴西圣保罗州立大学（UNESP）生物科学研究所的化学与生物科学系、巴西农业研究公司（Embrapa）以及巴拉那大学（UNIPAR）等机构。通讯作者为 Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha，第一作者为 Priscila Luiza Mello。
一、 研究背景与目的
牛乳腺炎，尤其是亚临床乳腺炎，是奶牛养殖业中最为普遍且经济损失最大的疾病之一。这种疾病主要由多种微生物引起，其中葡萄球菌属（Staphylococcus spp.）的细菌是最常见的病原体，约占总病例的50%。该属细菌不仅包括主要的传染性病原体金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），还包括一组日益受到关注的凝固酶阴性葡萄球菌（Coagulase-negative staphylococci, CoNS），如表皮葡萄球菌（S. epidermidis）、产色葡萄球菌（S. chromogenes）等。
这些葡萄球菌拥有多种毒力因子，其中形成生物膜（biofilm）的能力尤为关键。生物膜能够保护细菌免受宿主免疫系统的攻击，并形成一道屏障，阻碍抗菌药物（antimicrobial agents）的渗透，这常常导致慢性感染和对传统抗生素治疗的高度耐受性。生物膜的形成主要由icaADBC操纵子（ica operon）编码的多糖细胞间粘附素（polysaccharide intercellular adhesin, PIA）介导，此外，生物膜相关蛋白基因bap（biofilm-associated protein）和bhp也与不依赖于ica操纵子的生物膜形成途径有关。
尽管葡萄球菌及其生物膜在乳腺炎发病机制中的作用已被认识，但对于从巴西各地区分离出的CoNS的分子特征以及生物膜相关基因的实际表达情况，理解仍然有限。因此，本研究旨在利用分子方法，对从巴西六个州的牛亚临床乳腺炎病例中分离出的181株葡萄球菌进行全面表征，具体目标包括：1）通过RT-qPCR（反转录定量聚合酶链反应）检测并验证icaADBC操纵子以及bap和bhp基因的携带与表达情况；2）使用脉冲场凝胶电泳（Pulsed-field gel electrophoresis, PFGE）和多位点序列分型（Multilocus sequence typing, MLST）技术调查分离株之间的染色体相似性及克隆关系，从而增进对这些病原体传播和进化规律的了解，为制定有效的防控措施提供依据。
二、 研究流程与方法
该研究的实验流程清晰，主要分为菌株收集与鉴定、基因检测与表达分析、耐药表型分析和分子分型四大步骤。
首先，研究团队从Embrapa的菌种库中选取了181株葡萄球菌。这些菌株源自一项覆盖巴西六个州（南里奥格兰德州RS、圣卡塔琳娜州SC、巴拉那州PR、圣保罗州SP、米纳斯吉拉斯州MG和伯南布哥州PE）91个奶牛群的纵向监测项目。研究者通过生化试验（如过氧化氢酶、凝固酶试验及糖发酵试验）和内部转录间隔区PCR（ITS-PCR）技术，对菌株进行了精确的物种鉴定。结果显示，这181株菌中包括82株（45.3%）金黄色葡萄球菌和99株（54.7%）CoNS，后者涵盖了产色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌（S. saprophyticus）等9个不同物种。
其次，研究者提取了所有分离株的基因组DNA（gDNA），使用常规PCR技术检测了与生物膜形成相关的icaADBC操纵子基因、bap基因和bhp基因的存在情况。在此基础上，为了确认这些基因是否被激活，研究进行了关键的基因表达分析。他们提取了携带任一目标基因的菌株的总RNA，反转录为互补DNA（cDNA）作为模板，采用RT-qPCR技术对icaADBC这四个基因的mRNA转录水平进行了相对定量。实验选用16S rRNA基因作为内参基因，以标准生物膜产生菌株ATCC 35985和非产生菌株ATCC 12228作为参照，通过ΔΔCt法进行计算。
同时，研究采用E-test方法测定了所有分离株对苯唑西林（oxacillin）和万古霉素（vancomycin）的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC），并依据临床和实验室标准协会（CLSI）的折点标准判读其敏感性。
最后，为了揭示菌株间的进化与传播关系，研究实施了高分辨率的分子分型。所有181株分离株均接受了PFGE分析。研究人员使用限制性内切酶对全基因组DNA进行酶切，通过脉冲场电泳分离大片段DNA，并使用BioNumerics软件，基于Dice相关系数和UPGMA（非加权组平均法）聚类方法生成树状图，以80%的相似性为标准定义克隆簇（cluster）。在此基础上，研究者从PFGE定义的每个金黄色葡萄球菌簇和表皮葡萄球菌簇中至少选择一株代表菌株，进行了MLST分析。通过对七个管家基因（arcC, aroE, glpF, gmk, pta, tpi, yqiL）进行扩增和测序，将等位基因组合与MLST数据库比对，确定其序列型（sequence type, ST）和克隆复合体（clonal complex, CC）。
三、 主要研究结果
研究结果显示，基因的“携带”与“表达”之间存在显著差异。在gDNA层面，icaA基因的检出率为43.6%，icaD为70.1%，bap为36.4%，bhp仅存在于4.9%的表皮葡萄球菌中。然而，通过RT-qPCR对cDNA的分析证实，这些基因的mRNA表达率有所不同：icaA在75.9%的携带菌株中表达，icaD在63%的携带菌株中表达，而icaB和icaC的表达率较低，分别为25%和45.6%。这表明基因的存在并不等同于其功能状态。值得注意的是，金黄色葡萄球菌是生物膜基因表达的主力，在82株金葡菌中，有58株（70.7%）表达了icaA，62株（75.6%）表达了icaD，其中52株（63.4%）同时表达了这两个关键基因。相比之下，CoNS中这些基因的表达频率普遍较低，例如在27株产色葡萄球菌中，icaA的表达为0，icaD也仅有4株表达。这一结果表明，在亚临床乳腺炎的CoNS分离株中，ica操纵子介导的生物膜形成途径可能不如在金黄色葡萄球菌中那样普遍和活跃。
在耐药性方面，E-test结果显示，99%的金黄色葡萄球菌对苯唑西林敏感，而32%的CoNS对其耐药，表明CoNS的甲氧西林耐药性问题更为突出。所有分离株对万古霉素均敏感，MIC值均低于耐药折点。
分子分型揭示了重要的流行病学信息。PFGE分析成功识别出8个金黄色葡萄球菌克隆簇，其中最大的簇CSA1包含31株分离株，它们来自圣保罗州和米纳斯吉拉斯州的7个不同农场，这强有力地证明了该优势克隆株在不同农场间的广泛传播。在CoNS中，产色葡萄球菌形成了3个簇，表皮葡萄球菌形成了4个簇，值得注意的是，部分簇（如表皮葡萄球菌的CSE1和CSE2）的菌株跨越了多个州。这种跨地域的克隆传播模式，提示可能存在通过奶牛调运、挤奶设备污染或人员接触等途径导致的病原扩散。
MLST分析进一步深化了进化与溯源认知。金黄色葡萄球菌中最常见的序列型为ST126（属CC126）和ST1（属CC1），各占30%。ST1（CC1）是一个在全球范围内广泛发现于人、多种动物和牛乳腺炎病例中的克隆复合体，其在巴西奶牛中的检出，暗示了人畜间潜在传播的可能性，尽管这并非频繁事件。而ST126（CC126）则被文献报道为一种主要与牛乳腺炎相关、很少从人类分离的牛适应型克隆，其在多个农场和州的存在证实了特定牛源克隆株在巴西的流行。对于表皮葡萄球菌，每个PFGE簇都对应了不同的ST（ST59, ST81, ST48, ST575），其中还发现了一个新的序列型，经上报数据库后被命名为ST639。值得注意的是，ST59和ST81此前在德国牛乳腺炎、爱尔兰人鼻拭子和丹麦人伤口中均有报道，这再次表明某些葡萄球菌菌株具有跨越物种和地域传播的能力。
四、 研究结论、意义与亮点
本研究的主要结论是，在巴西导致牛亚临床乳腺炎的葡萄球菌中，生物膜相关基因的表达水平因物种而异，在毒力更强的金黄色葡萄球菌中更为显著。研究通过高分辨率分子分型，揭示了多个金黄色葡萄球菌和CoNS的优势克隆簇在巴西不同地区农场间的广泛传播，并识别出既有牛适应型（如CC126）、也有人畜共患潜力（如CC1）的国际流行克隆谱系。
这项工作的科学价值在于，它首次将基因表达数据与PFGE和MLST克隆分型数据相结合，系统分析了巴西多个地区奶牛群中葡萄球菌的分子流行病学特征，填补了相关地区CoNS分子特征的知识空白。其应用价值在于，研究结果为制定区域性的乳腺炎防控策略提供了关键的分子流行病学依据。例如，识别出广泛传播的优势克隆株CSA1，提示需要对其传播的农场进行重点干预，如严格挤奶卫生、隔离感染牛只、规范设备消毒等，以切断克隆传播链。
本研究的亮点主要体现在其研究方法的综合性和发现的独特性上。首先，方法学上的一大亮点是超越了简单的基因存在性检测，使用RT-qPCR深入分析了功能性的基因表达。这区分了“沉默基因”和“活跃基因”，更准确地反映了菌株的生物膜形成潜力。其次，分型技术的联合应用是另一大亮点。研究将PFGE的金标准鉴别能力与MLST的系统进化分析能力相结合，既能在短期内精确追踪暴发克隆，又能将其置于全球进化框架中，从而得出了“菌株与全球其他能感染人和动物的分离株具有相同进化起源”这一深刻见解。最后，一个特别值得关注的发现是，研究揭示了不同物种的菌株在同一农场乃至跨州形成克隆簇，这在以往的研究中较少被强调。这清晰地描绘了病原体在奶牛养殖系统中的动态传播图景，而不仅仅是单一优势种的爆
发，为“One Health（同一健康）”理念下的耐药菌株监测和跨物种传播风险评估提供了生动的案例。