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人类视锥细胞移植在小鼠视锥退化模型中的整合与功能研究
作者及机构
本研究由Sylvia J. Gasparini、Karen Tessmer等来自德国德累斯顿工业大学再生治疗中心（Center for Regenerative Therapies Dresden, CRTD）的团队主导，合作机构包括法国索邦大学视觉研究所、德国蒂宾根大学自然与医学科学研究所等。研究成果发表于*The Journal of Clinical Investigation*（JCI）2022年6月刊，标题为“Transplanted human cones incorporate into the retina and function in a murine cone degeneration model”。
学术背景
视觉障碍是工业化国家最常见的残疾之一，而多数致盲疾病与感光细胞（photoreceptor）不可逆的退化相关。哺乳动物（包括人类）的感光细胞缺乏再生能力，因此移植健康供体细胞成为潜在治疗策略。视网膜因其免疫豁免特性和结构封闭性，成为细胞替代疗法的理想靶点。然而，既往研究面临供体细胞纯度低、移植后结构紊乱、突触连接不足等问题。本研究旨在解决以下核心问题：
1. 如何高效富集人类视锥细胞（cone photoreceptor）供体？
2. 移植后人类视锥细胞能否在部分退化的宿主视网膜中整合并成熟？
3. 宿主微环境如何影响移植细胞的功能分化？
研究流程与方法
1. 构建人类视锥特异性报告基因iPSC系
- 方法：利用piggyBac转座子系统，将小鼠视锥抑制蛋白（mCAR）启动子驱动的GFP报告基因导入人诱导多能干细胞（iPSC），建立mCAR-GFP细胞系。通过核型分析和免疫荧光验证报告基因的特异性。
- 创新点：首次开发了可标记所有亚型视锥细胞（包括S-视锥和L/M-视锥）的iPSC系，解决了既往病毒标记效率低的问题。
2. 视锥富集与视网膜类器官分化
- 样本量：从分化第140天（D140）至D370的类器官中分选GFP+细胞，每组n≥3批次。
- 实验：流式细胞术（FACS）分选后，通过免疫染色（Arr3、RCVRN等）和单细胞转录组测序（scRNA-seq）验证纯度（达45%）。
- 关键发现：D200类器官的视锥细胞兼具成熟度（表达光感受器标记CRX）和高存活率，被选为最佳移植供体。
3. 移植至视锥功能障碍小鼠模型（cpfl1）
- 动物模型：cpfl1小鼠的视锥功能丧失但视杆细胞（rod）保留，模拟人类早期视网膜退化。
- 移植方案：将15万个人类视锥细胞注射至视网膜下腔，每月注射曲安奈德（triamcinolone acetonide）抑制免疫排斥。
- 时间点：移植后3周、10周、26周分析整合情况。
4. 移植细胞整合与功能评估
- 形态学分析：
- 免疫组化：GFP+细胞逐渐嵌入宿主外核层（ONL），形成极性化结构（内节朝向视网膜色素上皮/RPE，轴突延伸至内核层/INL）。
- 电镜：26周时观察到紧密堆叠的外节（outer segment）和连接纤毛（connecting cilium），为移植研究首次报道。
- 宿主互作：
- Müller细胞（胶质细胞）穿透移植物并形成粘附连接，模拟外限膜（OLM）结构。
- 双极细胞（bipolar cell）突触前标记CTBP2与宿主突触后标记mGluR6共定位，提示突触形成。
- 功能验证：
- 多电极阵列（MEA）：移植区域检测到光诱发的OFF型视网膜节细胞（RGC）反应，且可被代谢型谷氨酸受体阻断剂L-AP4抑制，证实信号来自移植视锥。
5. 转录组学分析
- 方法：分选移植后与体外培养的GFP+细胞进行RNA-seq。
- 结果：体内成熟的视锥细胞显著上调光转导（phototransduction）和线粒体功能基因，而体外类器官细胞未形成外节结构。
主要结果
1. 高效供体制备：mCAR-GFP报告系统实现视锥纯度>90%，远超既往标记面板（50%）。
2. 结构整合：移植后26周，60%移植物完全嵌入宿主ONL，且极性化程度随时间增强。
3. 功能成熟：宿主微环境促进外节形成和突触连接，电生理证实光信号传导。
4. 宿主依赖性：仅与宿主视网膜接触的区域出现内节发育，提示微环境指导分化。
结论与价值
科学意义：
- 首次证明人类视锥细胞可在部分退化视网膜中长期整合，并恢复光信号传导功能。
- 揭示了宿主Müller细胞和双极细胞在移植细胞成熟中的关键作用。
应用前景：
- 为年龄相关性黄斑变性（AMD）等视锥退化疾病提供治疗新策略。
- 建立的iPSC报告系统可用于视锥发育研究和表面标记筛选。
局限性：
- 移植细胞数量较少（15万/眼），需优化以提高功能检测灵敏度。
- 尚未在完全退化模型（如rd1小鼠）中验证整合能力。
研究亮点
1. 技术创新：开发首个全视锥特异性iPSC报告系统，解决供体纯度瓶颈。
2. 机制突破：揭示宿主胶质细胞通过形成OLM样结构促进移植细胞极性化。
3. 功能验证：结合电镜与MEA，多维度证实移植视锥的功能性突触传递。
其他发现
- 移植细胞年龄影响整合效率：D200细胞优于D250细胞，提示“年轻”供体更易适应宿主环境。
- 材料转移（material transfer）现象未被观察到，排除了既往小鼠研究中争议的细胞融合假说。
此研究为视网膜退行性疾病的细胞治疗奠定了关键理论基础，并提供了可转化的技术平台。