学术研究报告：褪黑素通过MT-1,2/Nrf2/ROS/NLRP3通路缓解耳蜗毛细胞氧糖剥夺/再灌注诱导的细胞焦亡

第一作者及研究机构
本研究由复旦大学附属眼耳鼻喉科医院的Yu Zheng、Na Gao、Weixun Zhang等共同完成，通讯作者为Fanglu Chi、Zhen Gao和Ning Cong。论文发表于《Molecular Neurobiology》期刊，2022年10月在线发表，DOI编号10.1007/s12035-022-03077-x。

学术背景
本研究属于听觉医学与神经生物学交叉领域，聚焦于突发性感音神经性耳聋（idiopathic sudden sensorineural hearing loss, ISSNHL）的病理机制及治疗靶点探索。耳蜗毛细胞对缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury, I/R）高度敏感，而ISSNHL的病因之一即为耳蜗血流中断导致的氧糖剥夺。尽管目前临床治疗手段有限，褪黑素（melatonin）因其抗氧化和神经保护作用在脑缺血再灌注损伤中表现出潜力，但其对耳蜗毛细胞I/R损伤的作用机制尚未明确。此外，细胞焦亡（pyroptosis）作为一种新型程序性细胞死亡形式，已被证实参与多种器官的I/R损伤，但在耳蜗毛细胞中的作用尚未被研究。因此，本研究旨在探究：（1）氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）是否诱发耳蜗毛细胞焦亡；（2）褪黑素是否通过特定通路发挥保护作用。

研究流程
1. 细胞与组织模型构建
- 研究对象：
- HEI-OC1细胞（耳蜗毛细胞样细胞系），用于体外模拟毛细胞损伤。
- 大鼠耳蜗外植体：取自出生后2天（P2）的Sprague-Dawley大鼠，培养于含B27的DMEM/F12培养基中。
- OGD/R模型：细胞和组织在无糖培养基、低氧条件（1% O₂）中培养4小时，随后恢复常氧和高糖培养基24小时，模拟I/R损伤。

1. 实验分组与药物处理

   • 分为5组：对照组（Con）、OGD/R组、OGD/R+褪黑素（M）组、OGD/R+M+褪黑素受体拮抗剂（Luzindole, L）组、OGD/R+M+Nrf2抑制剂（ML385）组。褪黑素浓度为100 μM，预处理2小时。
     

2. 检测方法与数据分析

   • 细胞活性与死亡标志物：CCK-8检测细胞活力；LDH释放实验评估细胞膜完整性；Hoechst 33324/PI双染观察细胞膜孔形成（焦亡特征）。
     
   • 氧化应激与炎症：DCFH-DA荧光探针检测活性氧（ROS）；Western blot和qRT-PCR分析MT-1、MT-2、Nrf2、NLRP3、caspase-1、GSDMD-N等蛋白表达；ELISA检测IL-1β和IL-18水平。
     
   • 统计方法：GraphPad Prism 6.0进行单因素方差分析（ANOVA），Tukey事后检验，p<0.05为显著。
     

主要结果
1. 褪黑素保护作用与受体依赖
- 100 μM褪黑素显著提高HEI-OC1细胞存活率（82.22% vs OGD/R组60.12%），并上调MT-1/MT-2受体表达。Luzindole完全阻断保护作用，证实褪黑素通过MT-1/MT-2发挥作用。
- 耳蜗外植体中，褪黑素减少毛细胞丢失（基底转毛细胞数：OGD/R组53.29 vs OGD/R+M组69.4）。

1. Nrf2/ROS/NLRP3通路机制

   • 褪黑素显著降低ROS水平，激活Nrf2及其下游抗氧化蛋白HO-1。ML385抑制Nrf2后，ROS水平和焦亡标志物（NLRP3、caspase-1、GSDMD-N）回升，表明Nrf2是褪黑素抗焦亡的关键靶点。
     
   • 炎症因子IL-1β和IL-18在OGD/R组显著升高，褪黑素处理后降低，但被ML385部分逆转。
     

2. 焦亡通路验证

   • Western blot显示OGD/R组NLRP3炎症小体激活（ASC寡聚化、caspase-1剪切），褪黑素抑制该过程。
     

结论与价值
本研究首次揭示：（1）OGD/R通过ROS/NLRP3通路诱发耳蜗毛细胞焦亡；（2）褪黑素通过MT-1/MT-2受体激活Nrf2，抑制ROS积累和NLRP3炎症小体组装，从而减轻焦亡。其科学价值在于阐明了耳蜗I/R损伤的新机制（焦亡参与）及褪黑素的神经保护通路；应用价值为ISSNHL提供了潜在治疗策略——靶向MT-1/MT-2或Nrf2的药物开发。

研究亮点
1. 创新性发现：首次证实焦亡参与耳蜗毛细胞OGD/R损伤，并解析褪黑素通过MT-1,2/Nrf2/ROS/NLRP3轴的保护机制。
2. 方法学贡献：结合HEI-OC1细胞与大鼠耳蜗外植体模型，多维度验证焦亡标志物（GSDMD-N膜孔形成、LDH释放）。
3. 转化意义：为临床ISSNHL的抗氧化治疗提供理论依据，提示褪黑素或其受体激动剂的潜在应用。

局限性与展望
研究未在成年动物体内验证褪黑素对听力恢复的效果，未来需补充听觉脑干反应（ABR）等行为学数据。此外，MT-1/MT-2受体在人体耳蜗的表达需进一步确认。