本研究报告基于发表在国际期刊 Redox Biology（第82卷，2025年，文章ID 103614）上的一篇原创性研究论文。该论文于2024年12月18日收到，2025年3月24日被接受，并于2025年3月25日在线发表。论文的主要作者是哈尔滨医科大学的Zhixi Li及其同事，通讯作者为Ziyong Yue教授。研究团队来自哈尔滨医科大学附属第二医院麻醉科、黑龙江省麻醉与危重病医学重点实验室、教育部心肌缺血重点实验室、国家寒冷地区心血管疾病重点实验室等多个机构，显示了该研究是一项多学科、多中心合作的深入探索。
本研究旨在揭示脓毒症诱导的急性肺损伤（Sepsis-induced Acute Lung Injury, SI-ALI）中，一种名为巨噬细胞外囊泡（Extracellular Vesicle, EV）介导的、全新的病理损伤机制，并在此基础上寻找潜在的治疗靶点。研究的学术背景主要聚焦于重症医学、免疫学和细胞生物学领域。脓毒症是一种由感染引发的全身性炎症反应综合征，常导致包括急性肺损伤在内的多器官功能障碍，死亡率高。肺微血管内皮屏障破坏是SI-ALI急性期的关键病理事件。巨噬细胞在脓毒症进展中扮演核心角色，但其损伤内皮细胞的具体机制尚不完全明确。近年研究发现，细胞外囊泡（EVs）作为细胞间通讯的关键载体，在炎症、氧化应激和细胞死亡等过程中发挥重要调节作用。尤其，巨噬细胞来源的EVs（Macrophage-derived EVs）被发现能够影响内皮细胞功能。另一方面，铁死亡（Ferroptosis）是一种铁依赖性的、以脂质过氧化为特征的调节性细胞死亡形式，有证据表明内皮细胞对铁死亡敏感，抑制铁死亡可能改善脓毒症预后。然而，在SI-ALI中，巨噬细胞EVs如何与肺血管内皮细胞相互作用、是否及如何通过铁死亡途径介导内皮损伤，仍是悬而未决的科学问题。因此，本研究旨在明确巨噬细胞EVs在SI-ALI中的作用，鉴定其中的关键分子，阐明其诱导内皮铁死亡的分子机制，并探索靶向该通路进行干预的治疗潜力。
研究流程复杂且系统，整合了临床样本分析、细胞模型、动物模型、多组学分析和计算机模拟等多种技术手段。主要流程可以概括为以下几个核心步骤：
第一步，现象观察与初步机制探索。研究团队首先利用小鼠盲肠结扎穿孔术（Cecal Ligation and Puncture, CLP）模型构建SI-ALI。他们发现，CLP小鼠肺部血管屏障蛋白（如ZO-1, VE-cadherin, Occludin）表达下降，血管通透性增加。免疫荧光显示，CLP小鼠肺组织中巨噬细胞（F4/80+）显著增多，且与内皮细胞（CD31+）紧密相邻。接着，在细胞层面，他们用脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）刺激人THP-1单核细胞系分化的巨噬细胞（模拟脓毒症状态，称为SMφ），收集其条件培养基与人肺微血管内皮细胞共培养。结果发现，SMφ条件培养基能导致内皮细胞死亡、脂质过氧化水平升高、线粒体膜电位降低，并下调铁死亡关键负调控蛋白SLC7A11和GPX4的表达。重要的是，用EV分泌抑制剂GW4869预处理巨噬细胞后，其条件培养基对内皮细胞的损伤作用被显著削弱，提示巨噬细胞可能主要通过分泌EVs来发挥损伤作用。
第二步，确认EVs的致病作用并鉴定关键分子。研究团队从LPS刺激的THP-1细胞（SMφ）上清中分离出EVs（SMφ-EVs），通过透射电镜、纳米颗粒追踪分析和蛋白印记验证了EVs的典型特征。将这些EVs与内皮细胞共培养，复现了条件培养基诱导的铁死亡和屏障破坏表型，且铁死亡抑制剂Ferrostatin-1可以逆转这些损伤。为了找到EVs中导致内皮损伤的关键分子，研究进行了多层次的筛选。首先，他们对SMφ-EVs进行了蛋白质组学测序。同时，对公共数据库（GEO）中与SI-ALI相关的两个转录组数据集（GSE2411, GSE130936）进行重分析，寻找差异表达基因。将蛋白质组学结果与转录组学结果取交集，并结合蛋白质-蛋白质相互作用网络分析，最终将目标锁定在鸟苷酸结合蛋白2（Guanylate-Binding Protein 2, GBP2）上。这一筛选过程逻辑严密，确保了目标分子的可靠性。临床验证显示，脓毒症患者外周血单核细胞和血浆EVs中的GBP2表达显著高于健康志愿者，且EVs中的GBP2水平与反映血管损伤的生物标志物（ANGPT2, Syndecan-1, STM）以及疾病严重程度指标（SOFA评分、D-二聚体）呈正相关，提示GBP2与临床病情密切相关。在动物和细胞模型中，LPS刺激的巨噬细胞及其分泌的EVs、CLP或LPS处理的小鼠肺组织巨噬细胞内，GBP2表达均显著上调。这些证据共同确立了GBP2作为候选关键分子的地位。
第三步，功能验证：GBP2是EVs诱导内皮铁死亡的必要分子。研究通过体外和体内实验验证了GBP2的功能。在体外，利用小干扰RNA（siRNA）敲低THP-1巨噬细胞中的GBP2，然后收集其EVs（siGBP2-SMφ-EVs）与内皮细胞共培养。结果发现，与对照EVs相比，siGBP2-SMφ-EVs诱导内皮细胞死亡、脂质过氧化和屏障蛋白丢失的能力显著减弱。反之，在巨噬细胞中过表达GBP2，其EVs的损伤能力增强。在体内，将敲低或过表达GBP2的Raw264.7细胞来源的EVs通过气管内滴注给小鼠，再进行CLP手术。结果显示，敲低GBP2的EVs能减轻CLP引起的肺损伤、细胞死亡和氧化应激，而过表达GBP2的EVs则会加剧这些损伤。为了更精准地探究巨噬细胞GBP2在体内的作用，研究团队构建了靶向巨噬细胞的腺相关病毒（AAV）以敲低GBP2（AAV-shGBP2），通过气管给药。在CLP模型中，AAV-shGBP2处理能显著提高小鼠生存率，减轻肺水肿、炎症和氧化损伤，并上调内皮细胞中GPX4的表达。这些功能获得和功能缺失实验有力地证明了GBP2是巨噬细胞EVs介导肺内皮铁死亡和损伤的核心效应分子。
第四步，机制探索：GBP2如何导致GPX4下调并诱发铁死亡？ 研究深入探究了GBP2的下游作用机制。他们发现，SMφ-EVs处理会显著增加内皮细胞中GPX4的泛素化水平，而蛋白酶体抑制剂MG132可以恢复GPX4蛋白量，表明GPX4是通过泛素-蛋白酶体途径被降解的。然而，免疫共沉淀实验显示GBP2并不直接与GPX4结合。通过文献调研和蛋白-蛋白对接分析，他们将目标转向了去泛素化酶OTU domain-containing protein 5 (OTUD5)，该酶已知可调节GPX4的稳定性。实验证实，在内皮细胞中，来自巨噬细胞EVs的GBP2能够直接与OTUD5结合。当敲低内皮细胞中的OTUD5时，即使巨噬细胞EVs中的GBP2被敲低，也无法阻止GPX4泛素化的升高。因此，机制被阐明：巨噬细胞来源的EVs将GBP2递送至肺血管内皮细胞，GBP2直接结合并可能干扰了OTUD5的功能，从而促进了GPX4的泛素化降解，导致内皮细胞对铁死亡的敏感性增加，最终破坏血管屏障。
第五步，治疗探索：寻找靶向GBP2的潜在药物。为了将基础研究发现转化为潜在的治疗策略，研究团队进行了高通量虚拟筛选，从天然化合物库中寻找能与GBP2蛋白结合的小分子。通过分子对接、分子动力学模拟和细胞热位移实验（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA），他们鉴定出车前子苷D（Plantainoside D, PD）与GBP2具有很强的结合亲和力。进一步的细胞实验显示，PD处理能抑制GBP2与OTUD5的相互作用，减少GPX4的泛素化，从而缓解SMφ-EVs诱导的内皮细胞铁死亡和屏障损伤。在动物实验中，PD单独治疗能改善CLP小鼠的生存率和肺损伤。更重要的是，将PD治疗与巨噬细胞GBP2敲低（AAV-shGBP2）联合应用，产生了叠加的肺保护效应。
本研究的主要结论是：在脓毒症诱导的急性肺损伤（SI-ALI）中，巨噬细胞通过分泌富含GBP2蛋白的细胞外囊泡（EVs），将GBP2递送至肺血管内皮细胞。GBP2通过与内皮细胞中的OTUD5直接结合，干扰了其对GPX4的去泛素化作用，导致GPX4发生泛素化降解。GPX4是抑制脂质过氧化和铁死亡的关键酶，其降解使得内皮细胞发生铁死亡，进而破坏肺微血管内皮屏障的完整性，加剧肺水肿和损伤。这一新发现的“巨噬细胞EV-GBP2/内皮细胞OTUD5-GPX4”轴是SI-ALI中内皮损伤的重要驱动机制。靶向该轴，例如使用小分子化合物PD抑制GBP2功能，或联合抑制巨噬细胞GBP2表达，展现出良好的治疗潜力。
本研究的科学价值和应用前景十分突出。科学价值在于：1) 首次系统揭示了巨噬细胞EVs通过递送GBP2介导肺血管内皮细胞铁死亡的全新病理机制，为理解SI-ALI中复杂的细胞间通讯和损伤模式提供了全新视角；2) 阐明了GBP2-OTUD5-GPX4这一全新的信号轴在调节内皮铁死亡中的作用，丰富了铁死亡的调控网络；3) 将临床样本分析、多组学筛选、分子细胞生物学验证和计算机辅助药物发现相结合，展示了一个从临床问题到机制探索再到治疗转化的完整研究范式。应用价值在于：1) 将GBP2确立为SI-ALI的潜在生物标志物和预后指标；2) 为SI-ALI提供了新的治疗靶点（GBP2），以及一种候选的先导化合物（PD），为开发靶向GBP2的小分子药物奠定了基础。
本研究的亮点在于：一、研究逻辑严密、系统性强：从现象到机制再到治疗，环环相扣，证据链完整。二、技术手段先进、整合度高：综合利用了蛋白质组学、转录组学、单细胞测序数据分析、分子对接与动力学模拟、细胞热位移实验等多种前沿技术。三、机制新颖且深入：不仅发现了GBP2这一关键分子，还深入揭示了其通过结合OTUD5并影响GPX4泛素化稳定性这一精细的分子机制。四、兼具转化潜力：不仅在基础机制上有所突破，还通过虚拟筛选和实验验证，找到了具有潜在治疗价值的小分子化合物PD，并验证了其联合治疗的增效作用，体现了从“实验室到临床”的转化医学思路。五、临床关联性高：研究始于临床问题，并始终贯穿临床样本验证，使基础研究发现具有坚实的临床相关性。
这项研究是一项高质量、具有重要理论和实践意义的原创性工作。它不仅深化了我们对脓毒症急性肺损伤发病机制的认识，更重要的是，它开辟了一条全新的治疗思路，为开发针对这一危重疾病的有效疗法带来了希望。