研究论文学术报告

主要作者及研究机构 本研究由Milagros Sempere Borau、Victor G. Gisbert、Josephine von Kempis、Laura M. Arroyo-Fernández、Samira Schiefer、David Alsteens及Silke Stertz共同完成。其中，Silke Stertz为通讯作者，来自苏黎世大学医学病毒学研究所（Institute of Medical Virology, University of Zurich）；David Alsteens来自比利时鲁汶大学生物分子科学与技术研究所（Louvain Institute of Biomolecular Science and Technology, UCLouvain）。该研究于2025年7月7日发表在期刊*PLOS Pathogens*上，论文标题为“Proximity labelling of internalizing influenza A viruses reveals a role for neogenin in virus uptake”。

研究背景 甲型流感病毒（Influenza A virus, IAV）是全球关注的呼吸道病原体。多数IAV的入侵依赖于病毒血凝素（hemagglutinin, HA）与细胞表面唾液酸（sialic acid）的结合，以实现病毒附着。然而，唾液酸本身不具备信号传导能力，无法单独触发病毒的内化（internalization）。因此，学界推测IAV在附着后还需与某种细胞表面受体相互作用以启动内吞。尽管已发现表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）、代谢型谷氨酸受体2（metabotropic glutamate receptor 2, mGluR2）等多种宿主因子可影响病毒内化，但这些因子的单独抑制或敲除均不能完全阻断病毒进入，提示IAV内化受体库尚不完整。Epsin 1是一种在网格蛋白介导的内吞（clathrin-mediated endocytosis, CME）中发挥关键作用的衔接蛋白（adaptor protein），且可与泛素化受体结合促进其内化。基于此，研究者假设：在病毒感染过程中，epsin 1可能位于内化受体附近。本研究旨在通过邻近标记技术（proximity labelling）获取IAV内化过程中epsin 1的相互作用组（interactome），以发现新的IAV内化受体。

研究流程与实验设计 研究的第一阶段是获取IAV感染时epsin 1的相互作用组。研究者构建了稳定过表达epsin 1-V5-TurboID融合蛋白的A549细胞系，以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）-V5-TurboID作为对照。TurboID是一种高效生物素连接酶，可在约35纳米范围内催化邻近蛋白的生物素化。细胞在冰上接种A/WSN/33（H1N1）病毒（感染复数MOI=100）以同步感染起始，随后在37°C含生物素的培养基中孵育30分钟，使病毒内化与生物素化同时进行。经链霉亲和素磁珠富集生物素化蛋白后，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行鉴定。质谱数据经无标记定量（label-free quantification）和SAINTexpress评分，筛选标准为SAINT概率评分≥0.6且丰度变化倍数>2。结果显示，在IAV感染条件下共鉴定出13个特异性epsin 1相互作用蛋白及21个在感染与非感染条件下均存在的蛋白。其中包含EGFR、AP2A2、MYO6等11个已知的epsin 1高置信互作因子，以及RPS5、AHCYL1等已知的IAV前病毒宿主因子，验证了方法的有效性。

研究的第二阶段为候选受体的筛选。对感染条件下检测到的潜在互作蛋白进行基因本体（Gene Ontology, GO）条目分析，筛选具有“质膜”（plasma membrane）注释且含有跨膜结构域的蛋白。结果得到三个候选受体：EGFR、nectin2和neogenin（NEO1）。其中，NEO1在IAV感染后富集倍数达2.78倍，而EGFR和nectin2未显示显著富集。进一步分析A549细胞表面蛋白质组数据发现，NEO1的表面丰度排名第125位（共428个表面蛋白），远低于EGFR（第11位）和nectin2（第25位），提示NEO1的富集具有感染特异性而非单纯的高丰度所致。此外，单细胞转录组数据显示NEO1在正常人原代支气管上皮细胞的多个细胞亚群中均有表达。

第三阶段验证NEO1与epsin 1的相互作用及与IAV的结合能力。在HEK293T细胞中共表达NEO1与epsin 1-V5-TurboID，经邻近标记和链霉亲和素富集后，免疫印迹检测到生物素化的NEO1，证实了二者的邻近关系。为直接评估NEO1与IAV的结合，研究者采用原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）单分子力谱（single-molecule force spectroscopy, SMFS）技术。将IAV病毒粒子通过柔性PEG24连接子共价连接至AFM探针尖端，NEO1通过NHS-EDC化学固定于金表面。力-距曲线显示IAV与NEO1之间可形成特异性粘附，加入抗NEO1抗体后结合频率显著降低，证明结合的特异性。通过改变接触时间测量结合动力学，得到结合速率常数kon=9.3±1.6 μm⁻¹s⁻¹；通过动态力谱（dynamic force spectroscopy, DFS）在不同加载速率下测量断裂力，拟合Bell-Evans模型得到解离速率常数koff=0.19±0.11 s⁻¹，解离常数Kd=21±14 nM，表明IAV与NEO1之间存在高亲和力相互作用。Williams-Evans模型预测的双键断裂力与实验观察到的双相互作用断裂力一致，表明单个病毒粒子可与多个NEO1受体形成多价结合。此外，用1 mM游离唾液酸（Neu5Ac）处理可使结合概率降低37±1%，用N-糖苷酶（N-glycosidase）去除NEO1的N-连接糖基化可使结合概率降低40±20%，说明IAV主要通过NEO1上N-聚糖末端的唾液酸与之结合。

第四阶段为功能验证。在A549细胞中用siRNA敲低NEO1表达，以非靶向siRNA（siScr）为阴性对照、靶向液泡ATP酶（vATPase）的siRNA为阳性对照。NEO1敲低未影响细胞活力，且有效降低了NEO1的mRNA水平。在A/WSN/33 Renilla报告病毒感染中，siNEO1 #1和#6使病毒复制的曲线下面积（area under the curve, AUC）分别降至对照的72%和59%，差异具有统计学意义。为检验特异性，研究者发现NEO1敲低不影响水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV）-GFP的复制，尽管VSV同样经CME进入细胞，表明NEO1的功能特异性指向IAV而非CME的普遍机制。进一步实验显示，NEO1敲低同样抑制了H1N1（A/Netherlands/602/09）、H2N2（重组报告病毒）和H5N1（A/Vietnam/1203/04）亚型Renilla报告病毒的复制，AUC分别显著下降，说明NEO1的前病毒功能不限于特定毒株或亚型。在原代MRC-5细胞及hTERT永生化的MRC-5细胞中，NEO1敲低同样降低了A/WSN/33 Renilla病毒的复制且无细胞毒性。此外，在A549细胞中敲低NEO1后以MOI=0.01感染野生型A/WSN/33，24和48小时的上清病毒滴度均显著低于对照组，证实NEO1在多周期病毒生长中发挥前病毒作用。

第五阶段为共定位与病毒进入实验。在稳定过表达NEO1的A549细胞（lv-NEO1）中以MOI=100接种A/WSN/33，感染后2和5分钟在非透膜条件下进行免疫荧光染色。结果在细胞表面检测到NEO1与IAV HA的共定位信号，但并非所有病毒粒子均与NEO1共定位。在透膜条件下，于感染后0、5、15和30分钟检测NEO1、IAV和网格蛋白重链（clathrin heavy chain, CHC）的共定位。通过Imaris软件进行斑点对象分析，结果显示IAV与CHC的共定位在感染后15分钟达到峰值，IAV-CHC-NEO1的三重共定位也在该时间点达到最高（尽管比例相对较低），提示NEO1可在IAV经CME内化过程中与病毒共内化。为直接评估NEO1对病毒进入的影响，利用β-内酰胺酶（β-lactamase, BlaM1）病毒样颗粒（virus-like particle, VLP）实验，在MRC-5细胞中敲低NEO1后感染携带A/WSN/33 HA和NA的BlaM1 VLP。流式细胞术检测显示，NEO1敲低使进入阳性细胞比例显著降低，证实NEO1在IAV进入阶段发挥促进功能。

主要结论与意义 本研究通过TurboID邻近标记技术获取了IAV内化过程中epsin 1的相互作用组，从34个IAV感染相关的潜在互作蛋白中筛选并鉴定neogenin为新的IAV内化受体候选分子。NEO1在A549细胞和原代人肺成纤维细胞中均展现出对多种IAV亚型（H1N1、H2N2、H5N1）复制的前病毒功能。AFM单分子力谱实验证明NEO1能以高亲和力（Kd=21±14 nM）直接结合IAV，且该结合主要依赖于NEO1上N-连接聚糖的唾液酸残基。免疫荧光显示NEO1可在感染早期与入侵病毒在细胞表面及内化过程中共定位。BlaM1 VLP实验进一步证实NEO1的缺失会降低IAV的进入效率。NEO1符合IAV内化受体的多项关键特征：在感染原发部位表达、可与病毒直接结合、在早期感染阶段与病毒共定位、且其缺失损害病毒进入。由于NEO1敲低不能完全阻断IAV感染，研究者推测IAV的内化受体可能存在功能冗余，多种受体可协同或替代性地触发病毒内化。该研究为理解IAV进入机制提供了新的重要线索，也为抗病毒药物设计提供了潜在的新靶点。

研究亮点 本研究的突出之处在于：其一，方法上创新地将TurboID邻近标记技术与病毒内化过程相结合，以epsin 1为“诱饵”捕获内化受体，克服了传统全基因组RNAi筛选难以发现途径特异性因子的局限。其二，运用AFM单分子力谱在单病毒-单受体水平上定量表征了NEO1与IAV的结合动力学和热力学参数，提供了直接而高分辨率的互作证据。其三，研究对象NEO1作为免疫球蛋白超家族成员，此前从未与IAV感染建立关联，本研究首次揭示了其在IAV进入中的前病毒作用，拓展了IAV内化受体候选库。其四，实验覆盖了多个IAV亚型和原代细胞，证实了NEO1功能的广谱性和生理相关性。这些特色使得该研究在病毒入侵机制领域具有较高的学术参考价值和方法学借鉴意义。