本文由Dake Qi、Haiyang Lin、Bingying Hu及Yang Wei*（通讯作者）合作完成，作者单位均来自杭州医学院药学院的浙江省神经精神药物研究重点实验室。该综述于2023年4月29日在线发表于《Journal of Controlled Release》第358卷，页码78-97，文章标题为《A review on in vitro model of the blood-brain barrier (BBB) based on hCMEC/D3 cells》。
1. 研究主题
本文系统综述了人脑微血管内皮细胞系hCMEC/D3在构建血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）体外模型中的应用，重点探讨了该模型的优化策略、屏障特性评估及其在药物渗透性研究中的价值。
2. 血脑屏障的重要性
BBB是由脑微血管内皮细胞（BMECs）、周细胞、星形胶质细胞等共同构成的特殊生理屏障，通过紧密连接（Tight Junctions, TJs）和转运蛋白严格控制物质进出脑组织。BBB的高选择性导致大多数中枢神经系统（CNS）药物难以通过，而外周药物则可能因意外穿透BBB引发神经毒性。因此，建立可靠的体外BBB模型对药物研发具有重要意义。
3. hCMEC/D3细胞的特点与挑战
hCMEC/D3是通过SV40大T抗原和hTERT永生化的人源脑微血管内皮细胞系，具有高通量、可重复性高、成本低等优势，但其屏障功能（如TJ蛋白表达、转运蛋白活性）较体内BBB弱。本文旨在总结优化该模型的方法，为研究者提供标准化建立和评价hCMEC/D3模型的参考。
hCMEC/D3模型通过三种屏障机制模拟BBB：
- 物理屏障：由TJs（如claudin-5、occludin）和黏附连接（AJs，如VE-cadherin）构成，但跨内皮电阻（TEER）仅10–300 Ω·cm²（低于体内150–400 Ω·cm²）。小分子（如荧光黄）渗透性较高，但大分子（如FITC-葡聚糖）渗透性与动物原代细胞相似[33]。
- 转运屏障：表达ABC transporters（如P-gp、BCRP、MRPs）和SLC transporters（如SLCO2A1），但与原代细胞相比，P-gp和BCRP表达量显著降低[37, 40]。
- 代谢屏障：主要表达CYP2U1和CYP2S1代谢酶，其他CYP亚型（如CYP3A4）几乎不表达[37]。
支持论据：多项研究通过PCR、蛋白质组学和功能性实验（如罗丹明123外排实验）验证了这些特性[30, 32, 33]。
培养基选择：EBM-2培养基能显著提高TEER和TJ蛋白表达，优于EndoGRO或DMEM。血清类型和浓度也影响屏障特性，人源血清（相比胎牛血清）可降低蔗糖渗透性39%[39]。
Transwell膜材料：聚酯（PET）膜（0.4 μm孔径）优于聚碳酸酯（PC）膜，BD Falcon品牌效果最佳[61, 69]。
基底膜蛋白：Ⅰ型胶原或纤维连接蛋白涂层可轻微降低TEER，而多聚-L-赖氨酸能增强屏障完整性[71]。
接种密度：10×10⁴ cells/cm²为最优密度，过高或过低均会降低TEER[71]。
糖皮质激素：100 nM氢化可的松（HC）可使TEER提高3倍，上调occludin和claudin-5表达[30]。但过量HC（>1 μM）可能抑制效果[50]。
抗氧化剂：白藜芦醇（10 μM）通过抑制AhR通路降低P-gp表达，但可能减弱代谢屏障功能[123, 124]。
Wnt通路调节剂：LiCl（10 mM）通过抑制GSK-3β增强β-catenin稳定性，提高P-gp和BCRP表达[108, 141]。
磷酸二酯酶抑制剂：西洛他唑（10 μM）通过cAMP/PKA通路增强TJ组装，但同时可能过度激活P-gp功能[95]。
静态Transwell模型：
- 与星形胶质细胞共培养：人原代星形胶质细胞（非永生化）可提高TEER至258 Ω·cm²，而永生化细胞（如SVG-A）效果有限[128, 173]。
- 与周细胞共培养：周细胞分泌TGF-β和angiopoietin-1可稳定TJ，但需注意分化状态影响[183]。
- 三重共培养：加入神经元后TEER提升（如SH-SY5Y细胞），但可能降低细胞活性[187]。
动态微流体模型：生理剪切力（4 dyn/cm²）可使TEER升至1200 Ω·cm²，远超静态模型[195]。