黄芩素与黄芩苷作为寨卡病毒抑制剂的研究报告

一、研究概况

本研究由马来亚大学医学院医学微生物学系的热带传染病研究与教育中心主导完成。主要作者包括Adrian Oo、Boon Teong Teoh、Sing Sin Sam、Sazaly Abu Bakar以及通讯作者Keivan Zandi（同时隶属于美国埃默里大学医学院儿科系生化药理学实验室）。该研究成果以简报的形式发表于《Archives of Virology》期刊2019年第164卷，于2018年10月2日被接收，同年11月3日在线发表。

二、研究背景与目的

寨卡病毒最早于1947年在乌干达寨卡森林的恒河猴体内被发现。此后，该病毒在非洲和东南亚国家仅引发散发性病例，其潜在威胁长期被忽视。直到2015年，美洲地区暴发了大规模寨卡病毒疫情，其中巴西成为重灾区，估计约有44万至130万人被感染。这一事件引发了全球性恐慌，主要原因在于寨卡病毒具有严重的致畸效应。约80%的感染者并无临床症状，而有症状表现者通常症状轻微，包括低热、斑丘疹、关节痛和非化脓性结膜炎。然而，感染寨卡病毒的孕妇所产新生儿可能出现小头畸形等先天性缺陷，此外该病毒感染还与格林-巴利综合征的发生存在持续关联。时至今日，针对寨卡病毒感染尚无任何有效的抗病毒药物问世。

在此背景下，黄酮类化合物等天然产物因其低毒性特征和在自然界中的高度丰度，引起了全球研究人员的广泛兴趣。已有研究表明，异槲皮苷、姜黄素和表没食子儿茶素没食子酸酯等天然化合物在体外实验中表现出抗寨卡病毒活性。本研究团队此前已证实黄芩素及其葡萄糖苷酸衍生物黄芩苷对登革病毒具有抑制功效。因此，本研究旨在系统评估这两种黄酮类化合物对寨卡病毒的抑制特性，探究其在病毒感染周期不同阶段的抑制活性，并通过分子对接模拟预测其与特定寨卡病毒蛋白之间的潜在相互作用，为后续深入阐明各自的抗病毒机制奠定基础。

三、研究方法与实验流程

本研究采用了一系列体外实验与计算机模拟相结合的方法，系统评估了黄芩素和黄芩苷的抗寨卡病毒活性。

在细胞与病毒模型方面，研究选用非洲绿猴肾上皮细胞（Vero细胞系）在含胎牛血清的DMEM培养基中培养。所使用的病毒株为亚洲谱系的波多黎各寨卡病毒株PRVABC59，该病毒在Vero细胞中增殖5天后，采用病灶形成单位减少试验方法进行滴定，后续实验均使用P15和P5代次的病毒。

在细胞毒性测定环节，研究采用MTS方法确定了两种化合物对Vero细胞的半数细胞毒性浓度（CC50）和最大无毒剂量（MNTD）。细胞接种后经不同浓度的化合物处理48小时，加入MTS溶液显色后测定光密度值。结果显示，黄芩素的CC50约为420 µM，MNTD约为155 µM；黄芩苷的CC50约为553 µM，MNTD约为207 µM。后续所有抗病毒实验均在无毒剂量范围内进行。

在加药时间点实验中，Vero细胞在感染寨卡病毒前2小时、感染同时、以及感染后1至10小时的不同时间点，分别接受黄芩素和黄芩苷处理。感染72小时后收集上清液，提取病毒RNA，采用一步法定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR），使用特异性靶向寨卡病毒NS2B区域的引物对病毒载量进行定量分析。

在初级抗病毒筛选实验中，研究分别针对寨卡病毒复制周期的四个关键阶段进行了评估：病毒吸附阶段、病毒进入阶段、细胞内复制阶段，以及化合物对胞外游离病毒颗粒的直接灭活作用。Vero细胞在24孔培养板中培养，各实验方案参照本团队此前对登革病毒的研究进行优化，将孵育周期调整为3天以适应寨卡病毒较短的复制周期。实验终点同时采用病灶形成单位减少试验和qRT-PCR两种方法对病毒产量进行测定。其中，病灶形成单位减少试验使用靶向病毒感染细胞表面表达的病毒包膜糖蛋白的抗体进行免疫染色，在立体显微镜下对病灶进行观察和计数。

在分子对接模拟方面，研究从蛋白质数据库获取了四种寨卡病毒蛋白质的晶体结构：NS1（PDB ID: 5IY3）、NS2B-NS3蛋白酶（PDB ID: 5GXJ）、NS5（PDB ID: 5TFR）以及包膜糖蛋白（PDB ID: 5JHM）。使用ChemDraw和Discovery Studio 2.5软件生成两种化合物的三维配体结构，随后利用AutoDock Vina 1.5.6和Discovery Studio 2.5软件执行分子对接模拟和分析。

在统计分析方面，研究使用GraphPad Prism 5软件生成剂量反应曲线，计算半数有效剂量（EC50）和选择性指数（SI），采用单因素方差分析判断统计学显著性。

四、主要研究结果

加药时间点实验结果显示，黄芩素和黄芩苷在各个时间点均能抑制寨卡病毒RNA的产生，且抑制模式呈现出明显差异。在感染前2小时进行预处理时，黄芩素使病毒释放量降低约62%，黄芩苷降低约55%，表明两种化合物具有预防性用药的潜力。黄芩苷在病毒感染早期阶段（0小时和1小时）表现稍优于黄芩素，而在感染后2至10小时的各个时间点，黄芩素始终表现出更强的抑制效力。

针对病毒复制周期各阶段的抗病毒实验获得了更为精确的定量结果。qRT-PCR分析显示，黄芩素在寨卡病毒进入后细胞内复制阶段的抑制活性最为突出，其EC50值约为0.004 µM，选择性指数高达约105,000。相较之下，该化合物在病毒进入阶段（EC50 ≈ 12 µM，SI ≈ 35）、直接灭活病毒阶段（EC50 ≈ 19 µM，SI ≈ 22）和病毒吸附阶段（EC50 ≈ 20 µM，SI ≈ 21）的效力依次递减。黄芩苷的表现模式与黄芩素形成鲜明对比：其最优抑制效果出现在寨卡病毒进入阶段，EC50约为14 µM（SI ≈ 40），而在抗吸附阶段（EC50 ≈ 15 µM，SI ≈ 37）、直接灭活阶段（EC50 ≈ 30 µM，SI ≈ 18）和抗细胞内复制阶段（EC50 ≈ 31 µM，SI ≈ 18）的效力相对较弱。病灶形成单位减少试验的结果与qRT-PCR分析呈现出高度一致的抑制模式。

分子对接模拟预测了两种化合物与寨卡病毒蛋白质之间的潜在相互作用。结果显示，黄芩素和黄芩苷均与寨卡病毒NS5蛋白表现出最强的结合亲和力，结合自由能分别为-8.4 kcal/mol和-10.4 kcal/mol。而两种化合物与病毒包膜糖蛋白的结合亲和力均为最弱（黄芩素-7.3 kcal/mol，黄芩苷-7.2 kcal/mol）。研究还进一步揭示了两种化合物与NS5蛋白结合区域内所涉及的分子间化学键和氨基酸残基的详细信息。

五、研究结论与价值

本研究证实，黄芩素和黄芩苷在体外能够有效抑制寨卡病毒的复制。两种化合物通过不同的机制发挥作用：黄芩素主要通过抑制病毒进入宿主细胞后的细胞内复制阶段发挥抗病毒作用，而黄芩苷则主要作用于病毒进入宿主细胞的阶段。黄芩素在病毒后进入阶段展现出卓越的抑制活性，其效力甚至优于已获FDA批准的核苷类似物索非布韦在同类细胞中的表现。

分子对接分析预测NS5蛋白是两种化合物的最可能靶点，这一发现与黄芩素在细胞内复制阶段的强效抑制活性高度吻合。然而，黄芩苷在病毒进入阶段的体外效力与其对包膜糖蛋白的弱结合亲和力之间的不一致性提示，其抗病毒进入机制可能涉及对宿主细胞因子的调控，例如对寨卡病毒进入人类成纤维细胞和胶质细胞至关重要的AXL蛋白，或通过刺激宿主干扰素γ的产生来间接发挥抗病毒作用。

从应用前景来看，两种化合物均具备良好的安全性和药代动力学特征。已有临床研究表明，健康受试者服用黄芩素和黄芩苷后未出现严重副作用，其最大血浆浓度和浓度-时间曲线下面积均处于本研究体外实验有效浓度范围内。两种化合物的体内半衰期较长，肾脏清除率低于1%。尤其值得关注的是，黄芩素已被证明可以增强滋养层细胞的迁移和侵袭活性，而黄芩苷可通过其抗氧化和抗自噬特性预防妊娠期糖尿病相关的胚胎心血管畸形，这些特性对于以孕妇为主要重症风险人群的寨卡病毒感染治疗具有特殊意义。

六、研究亮点

本研究的首要亮点在于系统阐明了黄芩素和黄芩苷两种结构类似物在寨卡病毒复制周期中截然不同的作用阶段和机制差异。黄芩素主要靶向病毒后进入阶段的细胞内复制过程，其EC50低至纳摩尔级别，显示出极高的抗病毒效力；而黄芩苷则在病毒进入阶段发挥主要作用。其次，研究通过比较两种化合物的结构差异——黄芩苷较黄芩素多一个葡萄糖苷酸基团——揭示了黄酮类化合物C7位羟基在抗黄病毒活性中的关键作用，为后续基于结构的药物设计和衍生物开发提供了重要线索。第三，研究采用了从体外细胞实验到计算机模拟的多层次整合研究策略，既验证了化合物的抗病毒表型效果，又初步预测了其分子靶点，两方面的证据相互印证又暴露出新的科学问题，为进一步的机制研究指明了方向。