本研究由Emilie Dugast、Sita Shah、Isabel Vogel等来自法国南特大学、雷恩大学、里昂大学等多所研究机构的研究人员共同完成，David-Axel Laplaud为通讯作者。论文发表于*Brain*杂志（由牛津大学出版社代表Guarantors of Brain出版），于2026年在线发表。
该研究属于神经免疫学领域，聚焦于多发性硬化（multiple sclerosis，MS）的病理机制。MS是一种中枢神经系统（central nervous system，CNS）的慢性炎症性脱髓鞘疾病，其特征是免疫细胞反复浸润CNS，形成局灶性病灶，导致急性炎症事件和神经功能缺损。既往研究已证实，记忆CD8⁺ T细胞在MS病变中数量超过CD4⁺ T细胞，并呈现显著的克隆扩增现象，与疾病严重程度和轴突损伤密切相关。然而，与MS疾病状态相关的特异性CD8⁺ T细胞表型尚未被明确定义，且该细胞群在单细胞分辨率下的表型和功能异质性仍不充分。因此，本研究旨在利用高维单细胞分析策略，系统解析循环记忆CD8⁺ T细胞在MS中的疾病相关亚群，探究其与CNS浸润群体之间的关系，并评估其作为早期疾病严重程度生物标志物的潜力。
研究采用了多队列、多方法的综合实验设计，共纳入9个独立队列和多种技术平台。首先，研究者利用单细胞定量PCR（single-cell qPCR）对队列1中的循环记忆非MAIT CD8⁺ T细胞进行分子谱分析，该队列包括多发性硬化患者（pwMS，589个细胞）、其他炎症性神经系统疾病患者（pwoind，554个细胞）和健康志愿者（HVs，183个细胞），检测了96个基因的表达。通过t-SNE聚类分析，研究者识别出六个细胞簇，其中簇D在pwMS中显著富集，高表达细胞毒性基因（GZMA、GZMB、GZMH、PRF1、GNLY）和NK相关受体（KLRC1/CD94、CD244/2B4），同时不表达NCAM1/CD56，因此被命名为“NK样CD8⁺ T细胞”（NK-like CD8⁺ T cells）。该簇与HV富集的低细胞毒性簇（lowCTL）形成对比。随后，研究者在队列2中使用流式细胞术（flow cytometry）对单细胞发现进行了蛋白水平验证，通过监督门控和非监督FlowSOM聚类分析，均确认了pwMS中NK样CD8⁺ T细胞比例的显著增加。
在临床关联分析中，研究者首先在队列1中发现，复发期采集的样本中NK样CD8⁺ T细胞簇的比例显著高于缓解期样本（33%对18%），提示该亚群与近期炎症活动相关。独立队列3（早期未治疗RR-MS患者）的谱系流式分析进一步证实，NK样CD8⁺ T细胞频率与距上次复发的间隔时间呈显著负相关，而lowCTL无此相关性。为评估该亚群的预后价值，研究者建立了前瞻性队列4，在患者首次临床事件时（治疗前）采集样本，并在两年后根据是否使用高效疾病修饰治疗（作为“侵袭性MS”的操作性定义）将患者分为侵袭性组（aggrMS，n=31）和非侵袭性组（naggrMS，n=29）。结果显示，aggrMS患者在发病时的NK样CD8⁺ T细胞百分比显著高于naggrMS患者（1.553%±1.017%对0.759%±0.509%）。此外，该细胞频率还与脊髓病灶、高病灶负荷和一年内疾病活动等侵袭性指标显著相关。值得注意的是，将NK样CD8⁺ T细胞频率与血清神经丝轻链（sNfL）和胶质纤维酸性蛋白（sGFAP）联合，预测侵袭性MS的曲线下面积（AUC）达0.93，高于任何单一标志物。
在克隆性和抗原注释方面，研究者通过单细胞TCR测序和bulk TCRβ CDR3免疫测序分析发现，pwMS中克隆扩增的记忆CD8⁺ T细胞优先定位于NK样簇（43.6%的克隆细胞对12.7%的非克隆细胞），而在HV中扩增克隆主要位于lowCTL簇。通过将CDR3序列与公共TCR数据库（McPAS-TCR和VDJdb）比对，研究者发现pwMS扩增克隆富集了被注释为EB病毒（Epstein–Barr virus，EBV）识别和炎症性疾病相关的序列，提示病毒免疫印迹可能参与了MS中扩增的细胞毒性库的形成。
为深入解析NK样CD8⁺ T细胞的转录程序，研究者对队列5中分选的NK样CD8⁺ T细胞和lowCTL进行了bulk RNA测序。差异表达分析发现94个上调和108个下调基因，上调基因富集于NK细胞介导的细胞毒性通路和DAP12信号通路。与独立数据集比较显示，尽管NK样细胞分选自CD45RA⁻群体，其转录谱更接近终末分化效应记忆T细胞（TEMRA）。随后，研究者在队列7中对首次临床事件患者的PBMC进行了CITE-seq/单细胞RNA测序，通过表面蛋白标签确认了CD8_NK-like簇的身份。比较侵袭性与非侵袭性MS样本发现，尽管簇比例相似，但NK样CD8⁺ T细胞在侵袭性MS中呈现更活化的转录状态，细胞毒性、炎症、NF-κB和TCR信号通路相关基因表达上调，而凋亡和干扰素相关程序相对下调。
在功能实验中，研究者利用队列8的新鲜PBMC评估了NK样CD8⁺ T细胞的细胞毒性能力。以缺乏HLA-I的K562细胞为靶细胞的直接杀伤实验显示，NK样CD8⁺ T细胞的杀伤活性显著高于lowCTL，且IL-15或抗CD3/CD28预刺激均能增强其杀伤功能。穿孔素和/或颗粒酶B抑制剂以及Transwell分离实验证实，该杀伤作用依赖可溶性介质和细胞-细胞接触。此外，NK样CD8⁺ T细胞还介导了微弱但可检测的CD16依赖性抗体依赖性细胞毒性（ADCC），但远弱于专业NK细胞。
为验证NK样CD8⁺ T细胞的CNS浸润，研究者对队列9的尸检脑组织进行了免疫荧光染色和空间转录组学分析。在活动性病灶（active lesions，ALs）中，CD3⁺CD8⁺CD94⁺细胞占CD3⁺ T细胞的9.8%和CD3⁺CD8⁺ T细胞的18.8%，显著高于外周血中的比例。空间转录组学（MERSCOPE平台，140基因panel）在12个病灶中确认了表达KLRC1/CD94和细胞毒性基因的NK样CD8⁺ T细胞状态，且这些细胞表达组织驻留记忆标志物（ITGA1、ITGAL、ITGAE、CXCR6、CD69），提示其进入CNS后获得了TRM样程序。空间相关性分析显示，NK样CD8⁺ T细胞频率与M2a型巨噬细胞频率呈强正相关（r²=0.7946），而lowCTL与M1型巨噬细胞相关，表明该亚群与病灶微环境中的特定髓系群体存在空间共定位。
本研究首次鉴定并系统表征了MS相关的NK样CD8⁺CD94⁺ T细胞亚群。该亚群具有寡克隆扩增特征，富集EBV注释TCR，表现出强大的抗原非依赖性细胞毒性，并在MS病灶中富集且与M2a巨噬细胞共定位。其在外周血中的频率与近期复发活动相关，且在首次临床事件时的高频率可独立预测两年后侵袭性病程。该研究为MS的免疫病理机制提供了新的细胞学基础，将外周炎症与CNS病灶联系起来，并提出了一个潜在的早期疾病严重程度生物标志物。联合NK样CD8⁺ T细胞频率与sNfL和sGFAP可显著提高预后预测效能，对临床早期治疗决策具有潜在应用价值。研究的主要亮点包括：利用高维单细胞技术定义了疾病相关的NK样CD8⁺ T细胞状态；通过多队列独立验证和功能性实验建立了从表型到临床关联的完整证据链；以及利用空间转录组学在组织原位确认了该亚群的存在和微环境关联。