介绍 单细胞转录组学技术近年来在植物科学研究中得到了广泛应用，极大地推动了我们对植物生长、发育以及对外界刺激响应机制的理解。然而，植物单细胞转录组数据的分析并非易事，主要挑战在于目前缺乏端到端的解决方案，整合各类生物信息学工具往往涉及大量依赖项，对缺乏生物信息学经验的植物学家尤其困难。针对这一问题，来自南京大学生命科学学院医药生物技术国家重点实验室的陈迪俊教授、张辰宇教授团队，联合华中农业大学作物遗传改良全国重点实验室的鄢文豪研究员等，在期刊 Plant Communications 上于2023年9月11日发表了一篇题为“scPlant: a versatile framework for single-cell transcriptomic data analysis in plants”的研究论文。该研究开发了一个名为 scPlant 的通用计算框架，旨在以最少用户输入实现对植物单细胞图谱的全面探索。作者 Cao Shanni、He Zhaohui、Chen Ruidong 等共同完成了该平台的构建与验证工作。
研究背景与目标 植物单细胞转录组测序基于原生质体分离或单核 RNA 测序技术，已在拟南芥、水稻、玉米等多个物种中产生了大量单细胞数据，使研究者能够在单细胞分辨率下解析复杂组织的细胞构成与基因表达动态。然而，现有分析工具多针对特定分析任务设计，例如细胞聚类、批次校正或轨迹推断，彼此之间缺乏统一接口，导致分析流程搭建繁琐且对用户技术要求较高。尽管哺乳动物领域已有若干最佳实践指南，但由于缺乏植物特异性知识库、标记基因数据库及相应的基因组注释资源，这些指南不能直接应用于植物。因此，开发一个集成多种功能、面向植物单细胞转录组数据的端到端分析平台具有重要价值。
scPlant 的设计目标包括：提供基础数据处理的核心模块；实现细胞类型自动注释与去卷积、发育轨迹推断、跨物种数据整合、细胞类型特异性基因调控网络构建等高级分析模块；并集成交互式可视化工具，使研究者能够快速探索数据。其唯一必需输入是来自单细胞 RNA 测序或单核 RNA 测序实验的一个或多个表达矩阵文件。
工作流程与功能模块 scPlant 主要由一个核心模块和若干高级模块组成。核心模块负责单细胞数据预处理，包括质量控制、批次效应校正、归一化、降维、细胞聚类、差异表达分析以及必要时多样本数据整合。scPlant 使用 Seurat 对象存储底层数据结构，并整合了来自哺乳动物领域的多种 R 包工具。质量控制步骤中，细胞需满足用户定义的最少表达基因数或 UMI 计数以及线粒体基因表达百分比上限；同时，由于植物细胞中检测到的基因数通常低于动物细胞，scPlant 采用较为宽松的过滤阈值，并利用叶绿体和线粒体等植物特有细胞器的基因表达特征辅助质控。批次校正采用 Seurat v.3 中的典型相关分析（CCA）和稳健主成分分析（RPCA）方法。降维环节支持 t-SNE 和 UMAP 两种算法，聚类采用基于 Louvain 社区检测的方法，并通过非参数 Wilcoxon 秩和检验识别各聚类的差异表达基因。
高级模块中，细胞类型自动注释是第一个案例。scPlant 集成了 SingleR、CellAssign、Garnett、scCatch、CellFunTopic 等多种预测工具，并实现了基于参考细胞图谱、标记基因数据库或功能注释的自动注释方案。研究者利用已发表的拟南芥根和稻根单细胞数据集构建了参考图谱，并在新数据集上测试了自动注释的准确性，包括对六倍体小麦的跨物种注释。此外，scPlant 提供了去卷积功能，利用 CIBERSORT 算法从批量 RNA 测序数据中推断细胞类型组成。
功能注释模块基于 CellFunTopic 包，通过基因集富集分析（GSEA）对每个细胞聚类进行功能术语打分，并利用主题模型（latent Dirichlet allocation）将功能术语映射到细胞聚类，实现细胞类型的功能标签化。通过网络可视化，研究者可直接观察不同细胞聚类之间的功能相似性。
轨迹推断模块整合了 Monocle2、Monocle3、CytoTRACE 和 Slingshot 四种常用工具。使用拟南芥根数据测试表明，不同工具预测的拟时序总体上呈正相关，但 CytoTRACE 可能在缺少先验信息时推断出错误的轨迹起点，而 Monocle2 和 Monocle3 允许用户指定起始细胞（如分生组织细胞）以提高准确性。
跨物种整合模块通过直系同源基因作为锚点，使用 CCA 和 RPCA 方法对拟南芥、水稻和玉米的根单细胞图谱进行整合。结果表明整合后主要细胞身份保持一致，物种特异性细胞类型得到保留，验证了该策略的稳健性。
基因调控网络（GRN）构建模块整合了 SCENIC 和植物特异性工具 MINI-EX。SCENIC 通过共表达分析和转录因子结合基序富集来识别调控子（regulon），而 MINI-EX 则进一步结合转录因子与靶基因的表达水平过滤调控子，从而产生更高的信噪比。此外，scPlant 还集成了配对基序富集工具 PMET，用于预测细胞类型特异性标记基因启动子区域内转录因子结合基序的共现。
结果与讨论 在案例1中，研究者利用拟南芥根（PRJNA517021）和水稻根（PRJNA706435）数据集构建参考细胞图谱，并在拟南芥另一数据集（PRJNA507252）和六倍体小麦单核 RNA 测序数据集（CRA008788）上测试自动注释。结果显示，基于参考图谱的 SingleR 和基于标记基因的 scCatch 均能获得较高预测准确率；CellFunTopic 方法在跨物种注释中也表现出良好性能。去卷积分析表明，在多种胁迫条件下，拟南芥根中维管组织和伴胞的细胞组成发生了显著变化。
在功能注释案例中，对拟南芥根数据集的 GSEA 显示，光合细胞富集了“叶绿体”“光系统”“辐射响应”等功能，内皮层细胞富集了“水分响应”“水通道活性”等功能。主题建模进一步发现，一个未注释的聚类（cluster 18）与皮层细胞聚类在功能上紧密相连，与细胞图谱中的空间位置一致。
在轨迹推断案例中，不同方法在拟南芥根数据集上的拟时序结果总体正相关，但 CytoTRACE 预测了错误的轨迹根（木质部细胞方向），而 Monocle2 和 Monocle3 在指定分生组织细胞为起始点后给出了正确轨迹。研究者建议根据轨迹拓扑结构和数据集维度选择合适的方法。
在跨物种整合案例中，拟南芥、水稻和玉米根细胞图谱整合后，分生组织细胞在整合图谱中保持聚集，且其标记基因（如 MAD2）表达高度保守且特异。这一结果证明了基于直系同源基因的整合策略能够保留关键细胞类型的生物学信号。
在基因调控网络案例中，SCENIC 和 MINI-EX 在多个细胞类型中预测出一致的调控子。例如，两种方法均识别出 bZIP44 为伴胞特异性调控子转录因子，ANAC030 为木质部细胞调控子转录因子。但 MINI-EX 的调控子富集分数信噪比更高，反映了其基于转录因子表达水平过滤的策略优势。PIF5 被鉴定为光合细胞的首要调控子转录因子，与其在光合作用和光保护中的已知调控功能一致。PMET 分析识别出光合细胞中 TCP14 和 TCP15 基序的显著配对富集，以及 ABI5 与 ABF 基序的共富集，这些结果均与已知的光响应和光合抑制机制一致。
结论与意义 scPlant 提供了一个专门针对植物单细胞转录组数据的端到端分析平台，解决了植物领域缺乏集成化分析框架的难题。其植物特异性基因组注释、标记基因数据库、调控基序数据库以及功能注释资源，使得细胞类型识别和功能注释更加准确。同时，scPlant 针对植物细胞特性调整了质量控制参数，并利用叶绿体和线粒体基因表达进行辅助质控。该平台集成了交互式 Shiny 应用（scPlant-app），使不具备编程基础的研究者也能通过网页界面深度挖掘特定细胞聚类、基因和调控网络。
该研究的应用价值在于，大幅降低了植物学家进行单细胞转录组数据分析的技术门槛。通过提供完整的工作流程和在线教程，scPlant 使研究者能够在 2–3 天内完成对多个公开数据集的全面分析，并轻松适配新的植物物种数据集。其跨物种整合、轨迹推断和基因调控网络构建功能，为解析植物发育轨迹、比较不同物种间保守的基因表达程序以及揭示细胞类型特异性调控机制提供了有力工具。
研究亮点 首先，scPlant 是首个面向植物单细胞转录组数据的端到端分析框架，整合了来自哺乳动物领域的多种成熟工具并进行了植物特异性适配。其次，该平台不仅包括基础数据处理，还涵盖了自动注释、去卷积、功能注释、轨迹推断、跨物种整合和基因调控网络构建等高级分析需求。第三，scPlant 首次将 MINI-EX 和 PMET 等植物特异性工具集成到统一流程中，并系统比较了 SCENIC 与 MINI-EX 的性能差异。第四，研究者利用公开数据集验证了平台在多个物种（包括六倍体小麦）中的适用性和跨物种注释能力。最后，scPlant 采用宽松的质控参数并利用植物细胞器基因进行质量控制，为植物单细胞研究提供了更加合理的分析策略。该平台在 GitHub 上免费提供给非商业用途使用，有望成为植物单细胞研究领域的重要基础设施。