西藏高原药用植物基因转化新方法研究综述

研究作者与来源

本文作者包括Ting Sun、Xinghao Han、Yuanyuan Jiang、Qiulin Li、Yuanjiang Xu、Fangyuan Zhang和Xiaozhong Lan，研究主要由西藏自治区农牧学院西藏药用植物资源保护与利用重点实验室、西南大学生命科学学院、重庆中国中药研究院等多个单位合作完成。该研究发表在《Medicinal Plant Biology》期刊的2025年第4卷（4: e002）上，文章标题为“A method of genetic transformation of Xizang medical plants without tissue culture”。研究DOI为：https://doi.org/10.48130/mpb-0024-0032。

研究背景

研究领域与意义
该研究属于植物遗传与药用资源保护领域，针对西藏特有、药用价值突出的植物种类——高原植物Mirabilis himalaica（巴竹）开展基因转化及功能研究。Mirabilis himalaica 是鸦葱科(Caryophyllales)植物的代表，仅分布于青藏高原干热河谷地带，因抗逆适应和药用特性受到当地居民的青睐。然而，由于对其需求的激增和分布的有限性，该物种受到种群保护的压力，已被IUCN(国际自然保护联盟)列为“近危”物种。

研究现状和不足
传统的植物基因转化手段（如Agrobacterium tumefaciens介导的组织培养技术）效率低下，且对高原适应性植物如M. himalaica 不具备普遍适用性。已有研究中，Lan等人建立了M. himalaica的毛状根(hairy root)培养模型，但目前尚无针对此植物再生完整基因转化植株的高效方法。为科学地研究M. himalaica特有的活性化合物生物合成路径、新颖的高原环境适应性遗传学特征以及对其药用资源的优化利用，建立非组织培养的新遗传转化系统显得至关重要。

研究目的

本研究旨在探索一种基于非组织培养技术的高效遗传转化系统。目标是通过构建基因报告系统（如荧光和色素基因）成功转化M. himalaica，同时探索利用植物特有组织（如其成熟叶片）来实现可规模化操作的新转化流程。

研究流程与方法

1. 实验所用材料

   • 植物样本：M. himalaica种子采集自西藏自治区林芝地区，此后在人工气候箱中培养至一个月龄，选择成熟叶片作为转化材料。
   • 菌株与报告载体：所用菌株为Agrobacterium rhizogenes K599。载体分别为含4个色素合成基因和EGFP基因的PYL1300H-CDGAEG，以及表达红色荧光蛋白的Cotton 2.0-tdTomato，由外部合作单位提供。

2. 遗传转化体系建立与实验细节

   • 筛选适合转化的外植体
     使用根段、茎段及叶片进行试验。实验结果表明根段和茎段均未能显著诱导芽或再生根，而成熟叶片不仅能于10天内生根，并于30天后生成1.3个不定芽，表现出超强再生能力。

   • 改进后的“切割-浸泡-芽化”（cut-dip-budding, CDB）遗传转化系统
     外植体叶片经过切割后，将其浸泡于含有A. rhizogenes K599菌体悬液的感染液中并真空处理5分钟，随后用固体培养基上的细菌层包裹外植体切口。处理后的叶片被种植于填满蛭石的培养基中，覆盖塑料膜以保持湿度。在约10天后出现毛状根，30天后不定芽开始生长。

   • 转基因植物验证
     初步筛选通过肉眼观察色素积累差异（如紫色或红色荧光）进行。之后，对获得的转基因植株采用qRT-PCR检测特定基因表达水平、小提DNA后使用PCR检测外源基因是否成功整合，进一步验证其转化成功率。实验还设计了对照组以区分野生型、转基因阳性植株及阴性植株。

3. 基因表达与功能检测
   基于荧光基因tdTomato或利用色素生成基因（如Betacyanin）的积累分析，作者进一步比较了野生型与转基因植株在外源基因转录水平及目标产物浓度上的差异。

4. 数据分析与关键转化效率统计
   提取毛细根定性数据、芽化率及阳性植株比例等，数据显示阳性生根率达76%-78%，但阳性植株的出现率较低，仅1.7%-2%。

主要研究结果

1. 高效外植体筛选 研究发现，M. himalaica成熟叶片具有极强的不定根及不定芽诱导能力，是为非组织培养转化流程的最优选择。

2. 转化效率与验证 改进后的CDB系统克服了以往传统组织培养模式的繁琐步骤，实现了在非无菌条件下的快速转基因操作，使得A. rhizogenes-mediated转化在整体操作效率和适应性方面具备显著优势，并成功将Betacyanin及tdTomato基因体系整合入M. himalaica中。

3. 功能验证与结果差异 实验揭示，经转基因培养的M. himalaica植株在叶片、根部及芽组织中均表现出较显著的色素及荧光积累。基因定量及HPLC分析显示，转基因植株的目标色素浓度高出野生型5-6倍，并在分子水平证明了4个外源遗传基因高表达。

研究结论与意义

本研究首次在一种西藏高原药用植物中成功实施基于非组织培养的转基因技术，标志着高海拔药用资源植物遗传操作的重大进展。创新性地确定了叶片为最优外植体，为高效率、低成本研究药用植物的基因功能及生物合成路径奠定了基础。

该研究对探索M. himalaica及其他西藏高原特有药用植物的生物活性成分具有重要价值，其方法学优势也将在遗传改良和合成生物学领域带来直接应用机会，推动绿色高产药用资源开发。

研究亮点

1. 提出了独特的CDB转化系统，并优化了流程。
2. 首次实现了西藏药用植物M. himalaica的完整转基因植株再生。
3. 验证了具有应用潜力的报告基因（Betacyanin及tdTomato）体系。
4. 显著提升了药用植物基因转化研究的操作效率，为非模型植物的遗传研究开创先河。

总体来说，这项研究不仅丰富了植物遗传学方法论库，还为濒危高山药用植物的保护和可持续利用提供了全新解决方案。