本文报道了一项利用光控DNA纳米胶囊（photocaged DNA nanocapsule）在细胞内实现可控解锁与开启的研究。该研究由Takeshi Tohgasaki、Yasuyuki Shitomi、Yihong Feng、Saisei Honna、Tomoko Emura、Kumi Hidaka、Hiroshi Sugiyama和Masayuki Endo等人完成，主要研究机构为京都大学大学院理学研究科化学系、京都大学物质-细胞统合系统研究所及FANCL研究所。该成果发表于《Bioconjugate Chemistry》杂志，于2019年2月27日在线发表，刊载于该刊2019年第30卷第7期，页码为1860–1863。

本研究的学术背景属于纳米生物技术与DNA纳米技术交叉领域。DNA折纸（DNA origami）技术的发展使研究者能够精确设计和构建纳米尺度的三维结构，这些结构因其可编程性和可功能化特性，在成像、诊断和治疗等领域具有广泛应用前景。然而，如何实现DNA纳米结构进入细胞后对其构象变化的时空调控仍然是一个挑战。光化学反应相对于其他分子开关反应具有独特优势，因为光照射可以在时间和空间上被精确控制，且无需向体系中额外添加其他分子。基于此，作者团队前期已构建了光响应二维和三维DNA折纸结构，用于控制组装与解组装以及构象变化。本研究的目的是将光响应DNA纳米结构引入活细胞，并在细胞内通过光照操控其构象变化，验证该体系作为递送载体的可行性。

在实验流程方面，研究可分为四个主要阶段：光笼锁定的纳米胶囊构建与表征、体外光诱导开启验证、细胞内摄取与毒性评价、单细胞选择性光控开启。首先，研究者构建了一种方形双锥体DNA纳米胶囊（nanocapsule, NC）。该胶囊由M13mp18单链DNA和大量订书钉链（staple strands）在含20 mM Tris缓冲液（pH 7.6）、10 mM MgCl₂和1 mM EDTA的缓冲体系中通过退火自组装形成。先形成开放结构，退火程序从85 °C降至15 °C，降温速率为-1.0 °C/min。随后加入五条光可裂解（photocleavable, PC）DNA链，从35 °C降至15 °C退火（降温速率-0.5 °C/min）以锁定闭合结构。五条PC链分布在纳米胶囊的前端和侧边，连接顶部和底部金字塔，确保闭合形态的稳定性。通过凝胶电泳和原子力显微镜（AFM）确认了光笼锁定纳米胶囊的成功组装。AFM图像显示光笼锁定纳米胶囊呈现双层方形结构，表明其处于紧密闭合状态。紫外照射10分钟后，AFM观察到完全开启的结构，包括双层半开放结构和连接两个正方形的单层全开放结构。在溶液水平的动态开启实验中，研究者在纳米胶囊前端顶部和底部分别标记了Cy3荧光染料和BHQ-2淬灭剂。紫外照射（350 nm）后，PC链被裂解，荧光淬灭得到恢复，荧光强度随时间增加，并在5分钟内完成解锁过程。

在细胞实验方面，研究者使用正常人表皮角质形成细胞（normal human epidermal keratinocytes, NHEK）作为细胞模型。首先验证了细胞的摄取能力，将40 nM的光笼锁定纳米胶囊加入培养基，在37 °C下孵育1小时。共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscope, CLSM）观察到FAM标记的纳米胶囊广泛分布于细胞质中。细胞毒性方面，LDH试验和MTT试验分别独立重复三次，结果显示在所用浓度最高达8 nM时，未观察到显著细胞毒性。随后在细胞内进行光控开启实验。细胞摄取纳米胶囊后，使用330–385 nm带通滤光片照射40秒，Cy3荧光强度在细胞内显著增加，说明淬灭的Cy3荧光通过PC链裂解和解锁得以恢复。荧光增加广泛分布于细胞质，部分与细胞器共定位（图2c中箭头所示），这表明纳米胶囊在细胞内能够发生光诱导开启且过程可被光照控制。

进一步地，研究者进行了单细胞光照射实验以实现选择性开启。纳米胶囊被标记了Alexa 488染料，同时使用Alexa 647染料和BHQ-3淬灭剂对监测开启过程。单细胞照射采用405 nm激光。共聚焦图像以Alexa 647（红色通道）与Alexa 488（绿色通道）荧光强度比值图进行分析。研究者选择了三个已经摄取纳米胶囊的细胞（细胞1–3，图3b中黄色圆圈标记）依次进行激光照射。照射前，细胞呈现较低红色（Alexa 647强度），照射后红色区域显著增加。时间序列图像每5秒采集一次，激光照射持续40秒。图3c显示细胞1在照射前颜色变化不大，照射后（图像4）荧光强度显著上升，关闭激光后强度得以维持。图3d显示对细胞2和细胞3依次照射可以分别独立地开启各自细胞内的纳米胶囊。三个细胞的荧光强度变化均呈现相似的开启行为趋势。这些结果表明，激光照射可以在单个细胞内选择性地打开已经摄取的光笼锁定纳米胶囊。

研究结论表明，光笼锁定纳米胶囊能够成功构建并递送至细胞内部。通过光照射实现了纳米胶囊的解锁与动态开启，且该过程可以通过荧光淬灭与恢复进行监测。单细胞激光照射实现了细胞内纳米胶囊的选择性开启，为时空可控的细胞内递送提供了实验依据。不过，作者也指出荧光淬灭/恢复的动态变化范围尚不显著，约为5倍，染料和淬灭剂的相对位置仍有待进一步优化。该体系此前已被证明可以在其较大空腔内包含金纳米颗粒而不改变光响应特性，因此有望发展为类似天然病毒体系的智能递送系统，用于递送较大的纳米材料和蛋白质至细胞内。

本研究的亮点主要体现在以下几个方面：第一，将光可裂解DNA链作为锁定元件整合到DNA折纸纳米胶囊中，实现了纳米胶囊从闭合到开启状态的光控转变。第二，通过荧光染料-淬灭剂对的标记，实现了解锁与开启过程的实时监测。第三，活细胞实验证明了该体系可被细胞摄取且无显著细胞毒性，并在细胞内完成光控开启。第四，利用单细胞激光照射技术实现了单细胞水平的时空选择性操控，这对于精准治疗和个性化药物递送具有重要意义。总体而言，这项工作为DNA纳米机器在活细胞内的操控提供了概念验证，也为未来构建更复杂的细胞靶向递送系统奠定了基础。