本研究由Eun S. Park、Sehee Kim、Shuning Huang、Ji Young Yoo、Jakob Körbelin、Tae Jin Lee、Balveen Kaur、Pramod K. Dash、Peng R. Chen及Eunhee Kim等人完成。主要研究机构包括德克萨斯大学休斯顿健康科学中心（University of Texas Health Science Center at Houston）的Vivian L. Smith神经外科系、诊断与介入影像系、神经生物学与解剖学系，以及德国汉堡-埃彭多夫大学医学中心（University Medical Center Hamburg-Eppendorf）的内科与肿瘤中心。该研究于2021年5月发表在《Annals of Neurology》上，卷号为89，页码为926至941。
脑动静脉畸形（brain arteriovenous malformations, bAVMs）是儿童和年轻人发生出血性卒中和神经功能缺损的主要原因之一。其病理特征为动脉与静脉之间缺乏毛细血管床的直接连接，形成异常血管缠结（nidus）。目前临床上对于bAVM的治疗手段极为有限，主要为手术切除、栓塞或立体定向放疗，且当病灶位于脑功能区时常导致严重并发症。超过95%的bAVM病例为散发性，无家族遗传史，然而其发病机制长期以来未被阐明，这也导致缺乏有效的药物干预手段。
近年来，KRAS基因突变在肿瘤中被广泛研究，其功能获得性突变可导致下游信号通路的持续性激活，引起细胞异常增殖。2018年以来，多项临床研究发现约60%的散发性bAVM患者切除的病灶组织内皮细胞中存在体细胞激活型KRAS突变，其中KRAS p.Gly12Val（KRASG12V）为常见类型。该发现为散发性bAVM的发病机制研究提供了全新方向。已有体外研究表明，KRASG12V过表达可破坏培养内皮细胞的钙黏蛋白连接，且该效应可被MEK抑制剂逆转，提示RAF/MEK/ERK信号通路可能在突变KRAS诱导的bAVM中发挥关键作用。
本研究的目的在于：利用一种新型的靶向脑内皮的腺相关病毒载体AAV-BR1，在小鼠脑内皮细胞中特异性过表达KRASG12V，验证该突变是否足以诱导散发性bAVM，并探讨其分子机制及潜在治疗靶点。
本研究采用多种实验方法，整体流程可分为以下几个主要环节：
1. 动物模型构建与病毒注射。 研究对象为5至6周龄的C57BL/6小鼠，共使用了65只小鼠，其中46只用于bAVM特征分析，19只用于MEK/ERK抑制实验。通过眶后静脉窦注射方式，将携带KRASG12V或GFP（对照）的AAV-BR1载体（5×1010基因组拷贝/只）系统性注入小鼠体内。AAV-BR1是一种通过衣壳蛋白上展示NRGTEWD肽段而特异性靶向脑内皮细胞的腺相关病毒载体，能在脑内皮中实现稳定转基因表达且外周器官脱靶效应极低。
2. bAVM形态学与影像学评估。 注射后8至9周，通过蓝色乳胶血管铸型技术对全脑血管进行可视化，观察血管缠结、供血动脉（feeding arteries, FAs）和引流静脉（draining veins, DVs）的形态。同时，利用7T磁共振血管成像（magnetic resonance angiography, MRA）和T2加权成像（T2WI）对bAVM进行无创检测和定位。bAVM按大小分为1级（<100,000 μm²）、2级（100,000–200,000 μm²）和3级（>200,000 μm²）。
3. 免疫组织化学与分子生物学分析。 使用多种标志物进行免疫荧光染色，包括内皮标志物CD31和isolectin B4、平滑肌细胞标志物α-SMA、周细胞标志物NG2、动脉标志物ephrin B2（EFNB2）和静脉标志物EphB4。同时检测了VEGF-A的mRNA和蛋白水平、磷酸化VEGFR2（pVEGFR2）的定位、Ki-67阳性增殖内皮细胞数量，以及磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）的表达水平。此外，通过qRT-PCR检测了VEGF-A、TGF-β、Notch-1、IL-6、IL-1β、TNF-α、MMP-2和MMP-9等因子的mRNA表达变化。Western blot用于检测KRAS下游效应分子（ERK、AKT、p38）的磷酸化水平。
4. 行为学与神经功能评估。 在注射后8周进行多项行为学测试，包括筑巢行为测试（评估系统性感觉运动功能）、嗅觉敏感性测试（使用稀释花生油）、高架四臂迷宫自发交替测试（评估空间工作记忆）、新物体位置识别和新物体识别测试（评估中间期识别记忆）、悬线测试和旋转棒测试（评估肌肉力量和运动协调能力）。
5. 药物干预实验。 从AAV-BR1-KRASG12V注射后1天开始，通过口服灌胃给予曲美替尼（trametinib，1 mg/kg）或溶剂对照，持续6周。在治疗开始后5周进行T2WI评估病灶数量，9周时进行乳胶铸型评估bAVM大小分级，并进行认知行为学评估。
1. AAV-BR1介导的KRASG12V过表达成功诱导bAVM。 注射AAV-BR1-GFP后，GFP与isolectin B4共定位于脑内血管，但肝脏等外周器官未检测到GFP信号，证实了AAV-BR1的脑内皮特异性。所有注射AAV-BR1-KRASG12V的小鼠（11/11只）均出现至少一个bAVM，平均每只小鼠出现4.1±0.7个病灶。乳胶铸型显示典型的缠结状异常血管团，与人类bAVM的形态特征极为相似，并可见清晰的供血动脉和引流静脉。bAVM主要分布在前脑区域，包括嗅球、大脑皮层、前嗅核和腹侧纹状体，与人bAVM的分布特点一致。病灶以3级（大）为主，与人类散发性bAVM倾向于较大的特点相吻合。雌雄小鼠间病灶数量和分级无显著差异。
2. 血管成分异常与动脉/静脉标志物共存。 在bAVM病灶中，CD31阳性血管与α-SMA和NG2的共定位呈现不规则和不完全的模式，部分血管仅表达其中一种标志物，反映了异常血管重塑。EFNB2（动脉标志物）和EphB4（静脉标志物）在病灶血管外层的CD31阳性内皮细胞上共存，提示动静脉分化标志的紊乱，这与动静脉分流的形成密切相关。
3. 内源性血管生成信号被激活。 bAVM组织中VEGF-A的mRNA水平较对照组织升高约2倍，pVEGFR2在病灶内皮细胞中呈局灶性显著增强。病灶内VEGF-A、TGF-β和Notch-1的mRNA水平也较同一只小鼠的完整脑组织明显升高。Ki-67阳性增殖内皮细胞在bAVM中显著增多，证实局灶性血管生成参与了突变KRAS诱导的bAVM形成。
4. 自发性脑出血与神经炎症。 KRASG12V/BEC小鼠在脑表面和深部出现多灶性出血，尤其在嗅球和腹侧中脑区域。H&E染色显示bAVM周围存在出血和血栓形成。免疫染色显示病灶周围Iba-1阳性小胶质细胞/巨噬细胞显著增多，且以激活态（bushy）或阿米巴样形态为主。IL-6、IL-1β、TNF-α、MMP-2和MMP-9的mRNA水平在bAVM组织中显著升高，无论在破裂（Ter-119阳性）还是未破裂的病灶中均可观察到炎症反应。
5. 神经功能缺损。 与对照小鼠相比，KRASG12V/BEC小鼠bAVM周围NeuN阳性神经元显著减少，活化的caspase-3阳性凋亡神经元增多。行为学测试显示，这些小鼠在筑巢行为、嗅觉敏感性、自发交替测试、新物体识别、悬线测试和旋转棒测试中均表现显著受损，提示感觉、认知、记忆和运动功能均存在障碍。
6. MEK/ERK通路介导bAVM形成并被曲美替尼抑制。 在体外实验中，AAV-BR1-KRASG12V转导的人脑微血管内皮细胞中p-ERK1/2水平显著升高，而p-AKT和p-p38无变化。体内bAVM组织中也检测到p-ERK1/2的显著升高，且p-ERK与CD31阳性血管共定位在病灶中更为密集。给予曲美替尼治疗后，T2WI显示异常病灶数量显著减少，乳胶铸型显示3级大病灶数量显著减少，而1级小病灶数量略有增加，提示曲美替尼主要抑制bAVM的生长而非完全阻断其起始。曲美替尼治疗还改善了KRASG12V/BEC小鼠的认知功能。
本研究首次利用AAV-BR1介导的脑内皮特异性KRASG12V过表达，在小鼠中成功建立了散发性bAVM模型，直接证实了KRAS突变足以驱动bAVM的发生。该模型在形态学、血管成分、分子信号、出血和炎症特征以及神经功能缺损等方面均高度模拟了人类bAVM的病理特征。
本研究的科学价值在于：（1）确立了KRAS体细胞突变在散发性bAVM发病中的因果关系；（2）提供了一个临床相关的bAVM动物模型，可用于深入研究其病理生理机制；（3）证明了MEK/ERK信号通路在突变KRAS诱导的bAVM中的关键作用，并验证了FDA已批准的MEK抑制剂曲美替尼对bAVM生长的抑制作用，为散发性bAVM患者的药物治疗提供了重要的临床前依据。该研究为开发针对KRAS突变型bAVM的非手术干预策略开辟了新的路径。
本研究的突出亮点体现在以下几个方面：首先，创新性地采用AAV-BR1脑内皮靶向载体，实现了在体、特异性的KRASG12V过表达，避免了传统转基因小鼠在胚胎期致死或发育代偿的问题。其次，所建立的bAVM模型展现出与人类散发性bAVM高度相似的缠结状血管团形态及供血动脉-引流静脉结构，具有较高的临床相关性。此外，研究通过曲美替尼干预证实了MEK/ERK通路在bAVM生长中的必要性，为药物靶向治疗提供了直接证据。最后，该模型同时呈现了出血、炎症、神经元凋亡和多种神经功能缺损，为全面研究bAVM的病理后果及治疗评估提供了有价值的平台。
作者还初步观察到AAV-BR1-GFP在脊髓血管中的转导效率低于40%，且部分KRASG12V/BEC小鼠的脊髓中出现发育不良血管，提示该建模策略可能也适用于脊髓动静脉畸形的研究。此外，研究团队指出曲美替尼可能引起高血压等副作用，在后续研究中需要谨慎评估其对bAVM出血风险的影响。作者还讨论了KRAS突变与VEGF信号激活之间的相互关系，认为ERK通路可能通过缺氧诱导因子-1α调控VEGF表达，但确切的时序关系和因果关系仍需进一步研究。