主要作者与研究机构
本研究由中国科学院生物物理研究所的朱冰（Bing Zhu）研究员领导，联合清华大学、北京大学与国家生物医学研究所等机构的研究人员共同完成。主要贡献者包括并列第一作者孙略（Lue Sun）与张岩（Yan Zhang），以及张珠强（Zhuqiang Zhang）、郑勇（Yong Zheng）、杜立林（Lilin Du）等。该研究成果于2016年8月19日发表在《Journal of Biological Chemistry》第291卷第34期上，标题为“Preferential protection of genetic fidelity within open chromatin by the mismatch repair machinery”。
研究背景
表观遗传系统（epigenetic systems）通常被认为是在基因组之外或之上发挥作用的生物调控系统，主要负责调控同一基因组在不同细胞类型中的差异性表达。然而，一个引人关注但研究较少的问题是：表观遗传系统是否能够直接影响遗传系统的保真度，即DNA突变的积累过程。突变率由DNA序列错误发生的速率和DNA修复的速率共同决定。当DNA合成错误发生后，DNA聚合酶的校正活性（proofreading activity）首先进行纠错；若错误逃逸了该机制，错配修复（mismatch repair, MMR）系统则成为防止复制错误固定为突变的主要保护机制。
已有研究表明，不同物种的自发突变率存在显著差异，但在同一物种内部基因组的不同区域突变率也存在变异。例如，异染色质（heterochromatin）区域被发现倾向于积累更多突变。然而，这一现象背后的机制尚不明确：是异染色质区域的DNA合成更容易出错，还是这些区域的DNA修复效率较低？为了直接探究表观遗传调控因子对突变积累的影响，以及染色质状态究竟是影响突变发生还是突变修复，研究者采用实验进化（experimental evolution）策略，以裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）为模式生物开展研究。
研究设计与实验流程
研究选择了裂殖酵母野生型（wild-type, WT）单倍体菌株LD331作为起始菌株，并分别敲除了六个表观遗传调控因子编码基因（clr4、set2、pcf1、slm9、dcr1、ago1）以及一个错配修复关键组分基因msh6。clr4编码H3K9特异性组蛋白甲基转移酶；set2编码H3K36特异性组蛋白甲基转移酶；pcf1和slm9分别编码染色质组装复合物CAF1和HIRA的亚基；dcr1和ago1是RNA干扰（RNAi）通路的核心组分；msh6是错配修复中MutSα复合物的关键亚基。所有敲除菌株均通过PCR和高通量测序数据验证。
实验进化流程如下：对每个菌株建立5条独立的突变积累（mutation accumulation, MA）系，共40条MA系。每条MA系在每个传代（passage）中均通过单细胞瓶颈（single-cell bottleneck）方式，即从固体YES平板上挑取单个菌落（直径约1 mm）接种至新平板。每个传代中细胞经历约19至21次有丝分裂。经过100次传代（P100）后，细胞距离起始点约2000代。在P0和P100时间点分别提取基因组DNA，进行双端高通量测序（paired-end 100或125 bp），48个样品（每个菌株5个P100样品加1个P0样品）的平均覆盖度为80至180倍。
研究者开发了一套特定的生物信息学流程来识别实验进化过程中积累的突变。对于唯一比对读段（uniquely aligned reads）上的突变，使用GATK（Genome Analysis Toolkit）进行变异检测。对于多重比对读段（multiple aligned reads）上的突变，由于重复序列在异染色质区域更为丰富，传统方法通常将其舍弃。本研究改进了分析策略：首先利用较长的双端测序读长，然后对于多重比对的读段随机分配一个重复位点作为目标位点，并排除那些恰好位于同一重复组中变异碱基上的突变。该流程能够较可靠地识别重复区域中的单核苷酸替换（single-nucleotide substitutions）和1 bp插入缺失（indels）。通过对ago1Δ P100-1株系中23个突变进行Sanger测序验证，除一个位于高度重复区域的突变因技术限制无法确认外，其余22个突变均验证为真实突变，证明了分析管线的可靠性。
在对化学诱变剂诱导突变的分析中，研究者使用了甲基硝基亚硝基胍（MNNG）和甲磺酸乙酯（EMS）处理msh6Δ、ago1Δ、clr4Δ、pcf1Δ和野生型菌株。MNNG可使胸腺嘧啶O4位或鸟嘌呤O6位烷基化，而EMS则将鸟嘌呤转化为O6-乙基鸟嘌呤。处理后的菌株同样进行高通量测序和突变分析。
为研究染色质可及性（chromatin accessibility）与突变率的关系，研究者进行了DNase I测序（DNase I sequencing）实验。由于裂殖酵母参考基因组在异染色质区域的不完整性影响了DNase I测序分析，研究者将分析聚焦于常染色质区域。将酵母基因组划分为1 kb窗口，根据DNase I测序读段密度对窗口排序并合并为100个单位，计算每个单位的突变率。
对于人类癌症数据分析，研究者利用国际癌症基因组联盟（ICGC）数据库中246例结直肠癌患者的外显子组突变数据集。根据微卫星不稳定性状态将样本分为微卫星稳定（microsatellite-stable, MSS）组和微卫星高度不稳定（microsatellite highly instable, MSI-H）组，分别代表错配修复功能正常和缺陷的癌症样本。利用ENCODE数据库中结直肠来源细胞系HCT-116的DNase I测序数据，将人类基因组划分为10 kb窗口，仅保留含有至少50 bp外显子DNA的窗口（共63,606个），按DNase I测序读段密度排序并合并为100个单位，计算每个单位中外显子区域的突变率。
主要研究结果
在实验进化分析中，研究者共鉴定出3,321个突变。野生型菌株积累的突变数最少，而msh6Δ菌株积累的突变数增加了约30倍，符合预期。值得注意的是，除set2Δ外，所有表观遗传调控因子缺失菌株均表现出突变总数的适度但统计学显著的增加，表明这些表观遗传调控因子可能在某种程度上参与了遗传保真度的保护。
关于突变类型的分析显示，野生型和表观遗传调控因子缺失菌株中indel与单核苷酸替换的比值约为0.9，而msh6Δ菌株中该比值达到5，表明MutSα复合物优先修复带有环出碱基的错配。进一步分析indel类型发现，多数菌株（包括野生型）积累的缺失（deletions）比插入（insertions）少2至3倍，而msh6Δ菌株的缺失数比插入数多约4倍，反映了约8倍的变化。这一结果表明，尽管插入和缺失都在双链DNA中形成环出结构，但错配修复机制对两者的识别存在差异——可能优先识别母链上的环出结构（对应缺失）。化学诱变实验进一步证实了这一点：MNNG处理使msh6Δ菌株的indel积累比其他菌株增加10至20倍，而单核苷酸替换则无明显差异，说明MNNG诱导的突变可能不是错配修复的理想底物。
最关键的发现来自对突变基因组分布的分析。研究者观察到msh6Δ菌株在唯一比对读段区域积累的突变数远高于其他菌株，而在多重比对读段（对应重复序列富集的异染色质区域）中的突变增加幅度则小得多。利用已发表的H3K9me2 ChIP-seq数据定义异染色质边界后，计算常染色质和异染色质中的突变率发现：在所有错配修复功能正常的菌株中，异染色质区域的突变率比常染色质高5至14倍；而在msh6Δ菌株中，这一差异被缩小至约1.5倍。这一结果直接表明，错配修复机制优先保护常染色质中的遗传保真度，而错配修复功能的丧失有效消除了异染色质中突变率升高的趋势。
DNase I测序与突变率的关联分析进一步支持了上述结论。在msh6Δ菌株中，自发突变率与DNase I测序读段密度呈强正相关（r²=0.61，斜率=1.02），即染色质可及性越高的区域突变率越高。而在msh6野生型组中，这种相关性几乎不存在（r²=0.09，斜率=0.11）。作为对照，MNNG诱导的单核苷酸替换在msh6Δ菌株和其他菌株中均未显示出与染色质可及性的正相关。
在人类结直肠癌样本中观察到一致的趋势。MSS组（错配修复功能正常）的外显子突变率与DNase I测序读段密度总体呈负相关（ρtotal=−0.86），且在低可及性区域（phase I）呈现较陡的负相关斜率（−2.12），在高可及性区域（phase II）斜率趋于平缓（−0.15）。然而，MSI-H组（错配修复缺陷）中，总体负相关几乎消失（ρtotal=0.16），且在低可及性区域（phase I）出现强烈的正相关（斜率=6.39，r=0.65），而高可及性区域（phase II）仅显示轻微变化（斜率=−0.34）。
结论与研究意义
本研究通过实验进化方法直接证明，错配修复机制在常染色质区域优先发挥保护作用，这是导致野生型裂殖酵母中异染色质突变率升高的重要原因。染色质可及性调控错配修复效率是该现象的主要机制之一。尽管不能完全排除晚期复制过程中的易错DNA合成对异染色质高突变率的贡献，但该研究明确指出错配修复机制的限制性访问是其中一个重要因素。
这一发现具有双重意义：一方面，常染色质区域富含活跃转录的基因，优先保护这些区域可减少对细胞有害的突变；另一方面，异染色质区域较高的突变率可能为进化过程中新调控元件甚至新基因的产生提供了原料。此外，人类癌症数据的分析表明，错配修复缺陷不仅改变了突变的总体数量，也深刻改变了突变在基因组中的空间分布格局，这对理解肿瘤突变负荷的异质性具有重要意义。
研究亮点
本研究的创新性体现在以下几个方面：第一，采用实验进化策略直接比较不同基因缺失菌株的突变积累，避免了回顾性分析中可能存在的混杂因素；第二，开发了一套能够分析重复序列区域突变的新方法，克服了传统流程在异染色质区域突变检测中的技术瓶颈；第三，将裂殖酵母的实验数据与人类癌症样本数据进行了跨物种比较分析，证明了错配修复与染色质可及性相互作用在进化上具有保守性；第四，揭示了染色质可及性对DNA修复效率的调控作用，为理解基因组突变率空间异质性的形成机制提供了新的视角。