单细胞全基因组测序新突破：基于数字微流控的Digital-WGS平台

作者及发表信息
本研究由厦门大学化学化工学院化学工程系、化学生物学系的阮庆宇、阮卫东、林晓烨、王洋、邹芬香、周雷吉、朱志、杨朝勇（通讯作者）等合作完成，发表于*Science Advances*期刊2020年12月9日的第6卷第50期（DOI: 10.1126/sciadv.abd6454）。

学术背景

研究领域：单细胞基因组学（single-cell genomics）与微流控技术（microfluidics）。
研究动机：单细胞全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）是解析细胞间基因组异质性的关键技术，但现有方法存在样本制备复杂、扩增偏倚高、外源DNA污染等问题。传统全基因组扩增技术（whole-genome amplification, WGA）如多重置换扩增（multiple displacement amplification, MDA）虽广泛应用，但受限于指数扩增导致的覆盖不均和错误率高等缺陷。
研究目标：开发一种自动化、高效、低偏倚的单细胞WGS样本制备平台——Digital-WGS，通过数字微流控（digital microfluidics, DMF）技术实现单细胞捕获、裂解、扩增的全流程集成，提升测序数据的均一性和准确性。

研究流程与方法

1. 平台设计与单细胞捕获

核心创新：
- 蝴蝶结构（butterfly structure）：结合流体动力学陷阱与表面润湿性，通过亲水性虚拟微阱（hydrophilic virtual microwells）实现单细胞高效捕获（效率100%）。
- 数字微流控芯片：电极阵列设计包括试剂分配单元、细胞裂解区、扩增区等，通过电润湿（electrowetting-on-dielectric, EWOD）操控纳升级液滴（150 nL）。

实验验证：
- 细胞兼容性：测试K562（悬浮细胞）和MRC-5（贴壁细胞）等多种细胞系，捕获效率均达100%，且无细胞损伤（通过彗星实验验证DNA完整性）。
- 参数优化：沉降时间30秒、细胞浓度2.5×10³ cells/μL时捕获效率最佳。

2. 单细胞全基因组扩增（MDA）

关键改进：
- 体积效应：150 nL反应体系可提高模板DNA有效浓度，减少引物重复结合，降低扩增偏倚（CV=0.15）。
- 自动化流程：细胞裂解（碱性裂解液）、中和、MDA扩增（Repli-G单细胞试剂）均在芯片上完成，避免交叉污染（外源DNA占比仅0.2%）。

性能对比：
- 与传统MDA、液滴MDA（droplet MDA）、商业化微流控MDA（Fluidigm C1）相比，Digital-WGS的覆盖广度（35.5%）和均一性（Lorenz曲线最接近未扩增样本）显著提升。

3. 测序与数据分析

实验设计：
- 低深度（0.75×）与高深度（10×）测序：使用Illumina HiSeq 4000平台，比对至GRCh37参考基因组。
- 变异检测：
- 拷贝数变异（CNV）：52.4 kb分辨率下检测到最小150 kb的CNV，与批量样本一致性高。
- 单核苷酸变异（SNV）：等位基因丢失率（allele dropout rate, ADO）仅5.2%，显著低于传统MDA（65.5%）。

算法支持：
- 动态分箱（dynamic binning）和HMMcopy软件用于CNV调用，samtools/bcftools用于SNV检测。

主要结果与逻辑链条

1. 单细胞捕获效率：蝴蝶结构通过流体聚焦实现无偏倚捕获，为后续高质量扩增奠定基础。
   
2. 扩增均一性：小体积反应体系（150 nL）和封闭式液滴操控减少了外源干扰，CV值低至0.15。
   
3. 变异检测能力：高分辨率CNV和低ADO率SNV的检出，验证了平台在肿瘤异质性（如K562细胞）和胚胎发育研究中的潜力。
   

结论与价值

科学意义：
- 解决了单细胞WGS中扩增偏倚和样本损失的瓶颈问题，为基因组异质性研究提供了可靠工具。
- 数字微流控的自动化设计降低了操作复杂度，成本低至每样本0.07美元（传统方法20美元/细胞）。

应用前景：
- 罕见样本分析：如循环肿瘤细胞（CTC）、产前诊断样本。
- 高通量扩展：通过增加电极数量或结合组合索引（combinatorial indexing），可实现数千细胞并行处理。

研究亮点

1. 技术创新：首款集成单细胞捕获、裂解、扩增的DMF平台，捕获效率与均一性达行业领先水平。
   
2. 方法优势：封闭式液滴操作避免了污染，150 nL反应体系优化了扩增动力学。
   
3. 多尺度验证：从CNV（150 kb）到SNV（ADO 5.2%）的精准检测，覆盖基因组变异全谱。
   

其他价值

• 兼容性：适用于不同细胞类型（大小、表面特性无偏倚），且芯片设计灵活可调（电极尺寸30–120 μm）。
  
• 开源数据：测序数据已上传至SRA数据库（编号SRP262658），可供同行复现与拓展研究。
  

（全文约2000字）